176294. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének és antitestek meghatározására
29 176294 30 A kapott kalibrációs görbe alkalmazásával meghatározhatjuk terhes nők vérszérumában a humán chonon-gonadotropint. 9. példa Műanyag kémcsőbe bemérünk 0,1 ml, az 1. példa (1) pontja szerinti módon készített, antifibrinogénnel érzékenyített latex-reagenst (ahol a polisztirol-latex-részecskék átlagos átmérője 0,481 mikrométer, és az érzékenyített latex-részecskék koncentrációja 1 súly%). Hozzáadunk 0,3 ml standard fibrinogén-oldatot, amely fiziológiás nátriumklorid-oldatban 0,5 súly% marhaszérum-alburfínjt tartalmaz, és koncentrációja a XIV. táblázatban van megadva. Az elegyet 3 órán át rázatjuk percenként 200 rázatással. Ezután meghatározzuk az extinkciót 1,2 mikrométer hullámhosszúságú fény alkalmazásával az 1. példa (2) pontjában megadott módon. A kapott eredményeket a XIV. táblázatban mutat juk be. XIV. Táblázat A standard fibrinogén-oldat koncentrációja, ng/ml Exiinkció 1,2 a 10 0,048 20 0,125 40 0,324 60 0,540 80 0,718 100 0,802 Ha a fenti számértékek alapján kalibrációs görbét állítunk fel, akkor egyértelmű összefüggést tapasztalunk a standard fibrinogén-pldat koncentrációja és az extinkció között. így a találmány szerint lehetőség nyílik rendkívül csekély, nanogramm/ml fibrinogénmennyiségek meghatározására, olyan érzékenységgel, amely összehasonlítható a radioimmun-vizsgálati módszer érzékenységével. 10. példa Antifibrinogénnel érzékenyített latex-reagenseket állítunk elő az 1. példa (1) pontjában jsmertetett módon, azzal az eltéréssel, hogy 0,35 mikrométer átlagos részecskeátmérőjű polisztirol-látexet alkalmazunk. A kapott, antifibrinogénnel érzékenyített latex-reagensek 0,75, 1,0 illetve 2,0súly% koncentrációjúak. Minden egyes, ilyen módon készített, antifibrinogénnel érzékenyített latex-reagensre kalibrációs görbét állítunk fel az 1. példa (2) pontjában leírt módon, (1,2 mikrométer hullámhosszúságú fény és 10 perces rázatás alkalmazásával). A kapott kalibrációs görbéket a 12. ábra mutatja be. Amint az ábráról látható, a fibrinogén kimutatásának érzékenysége növekszik az antifibrinogénnel érzékenyített latex-reagensben jelenlevő érzékenyített latex-részecskék koncentrációjával. 11. példa (1) anti(humán immunglobulin E)-antitesttel érzékenyített latex-reagens készítése Glicinpufferrel készített, 2 mg/ml koncentrációjú anti(humán immunglobulin E)-antitest-oldathoz hozzáadjuk 0,109 mikion és 0,220 mikron átlagos' átmérőjű polisztirol-latex 1 :1 térfogatarányú elegy ének 1 ml-ét, amely 10 súly% szilárd anyagot tartalmaz. Az elegyet 30 percig keverjük szoba-1 hőmérsékleten, majd 40 °C-ra melegítjük, és további 30 percig keverjük ezen a hőmérsékleten. Végül 2—A °C-ra hűtés közben centrifugáljuk 50 percig 12 000/perc fordulatszámmal. A csapadékot dekantálással elválasztjuk, és az elkülönített anti(humán immunglobulin E)-antitesttel érzékenyített latex-részecskéket 0,2 súly% koncentrációjú marhaszérum-albumin-oldatba szuszpendáljuk. A kapott reagens 0,33 súly% koncentrációban tartalmazza az érzékenyített latex-részecskéket. (2) Kalibrációs görbe felvétele Műanyag kémcsőbe bemérünk 0,1 ml anti(humán immunglobulin E)-latex reagenst (amelyet az (1) pontban leírtak szerint készítünk), és hozzáadunk 0,2 ml standard humán immunglobulin E oldatot (amely izotóniás nátriumklorid-oldattal készült, és 0,2 súly% marhaszérum-albumint tartalmaz), amely a XV. táblázatban megadott koncentrációban tartalmazza a humán immunglobulin E-t. Az antigén-antitest reakció elősegítésére az elegyet keverjük. Közvetlenül ezután a kémcsőben levő reakcióelegyet 4 mm szélességű fényabszorpciós üvegküvettába töltjük, és 0,94 mikrométer hullámhosszúságú fény alkalmazásával, 140 másodperc elteltével meghatározzuk az extinkcióját automatikusan regisztráló spektrofotométer (Hitachi Ltd., Modell EPS—3) segítségével. Összehasonlító oldatként egy olyan szuszpenziót alkalmazunk, amelyet 0,1 ml anti(humán immunglobulin E)-latex reagens 0,2 ml fiziológiás nátriumklorid-oldattal történő hígításával kapunk, és amely 0,2 súly% marhaszérum-albumint tartalmaz. A kapott eredmények a XV. táblázatban láthatók. Ha a XV. táblázatban feltüntetett értékeket grafikusan ábrázoljuk, mégpedig a standard humán immunglobulin E oldat koncentrációját az abszcisszán, a 0,94 mikrométer hullámhosszúságú fénynyel kapott extinkciót pedig az ordinátán, akkor a 13. ábrán látható kalibrációs görbéhez jutunk. A kapott kalibrációs görbe felhasználásával meghatározhatjuk a betegektől vett szérumokban jelenlevő humán immunglobulin E-t. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
