176294. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének és antitestek meghatározására
3 176294 4 adotropin (heg) (hCG), stb., amelyeknél bonyolult műveletek szükségesek a reagens elkészítéséhez, és amelyeknél nehezen érhető el reprodukálható agglutinációs reakció, amikor az említett anyag a vérben vagy a vizeletben van jelen, mivel mind a vér, mind pedig a vizelet tartalmaz különféle, a reakciót esetlep hátrányosan befolyásoló más anyagokat is. Egy további szakcikkben [Immunochemistry, 12.349- 351 (1975)] eljárást ismertettek antitestek vagy antigének kvantitatív meghatározására. Az ismert eljárás szerint a fentebb említett, agglutinált latex-részecskéket lézersugárral sugározzák be, és mérik a lézersugár szórt fénye színképvonalainak a szélességét. A mérésből meghatározzák a közepes diffúziós állandót (D), amely jelzi az agglutinált részecskék Brown-féle mozgását. Ez utóbbi viszont fordítva arányos az agglutinált részecskék méretével. Ennél az ismert eljárásnál is — mivel az antigént vagy antitestet hordozó latexet rendkívül csekély koncentrációban, például akár 0,001% koncentrációban alkalmazzák — annyira lecsökken az antigén-antitest reakciósebessége, hogy sem a mérés pontossága, sem pedig a reprodukálhatósága nem kielégítő. Ezen túlmenően, hátrány még, hogy a színképanalízis módszerének alkalmazása bonyolult számolást von maga után, a szükséges műveletek szintén bonyolultak, és a mintában esetleg jelenlevő szennyező anyagokat a mérés előtt el kell távolítani. Mindezen hátrányok következtében ezt az ismert eljárást sem alkalmazzák a gyakorlatban. A fentebb idézett Immunochemistry, 12.349— 351 (1975) szakcikk egyúttal utal a zavarosság mérésén alapuló ismert eljárásra, megjegyezve, hogy az rendkívül pontatlan eredményeket ad (2. ábra a 350. oldalon). Ezért a találmány feladata olyan eljárás biztosítása, amelyek segítségével a vizsgálandó mintában jelenlevő antitest és/vagy antigén nagy pontossággal és jól reprodukálhatóan, gyorsan meghatározható. A találmány további célja olyan eljárás kidolgozása, amelyek segítségével gyorsan kimutatható, hogy valamely antitest vagy antigén koncentrációja a mintában nagyobb vagy kisebb egy meghatározott értéknél, s a vizsgálat rendkívül csekély mintamennyiségből elvégezhető. A találmány további célja eljárás biztosítása olyan rendkívül kis mennyiségű antigén és/vagy antitest meghatározásához, amely korábban gyakorlatilag csak a radioimmun-vizsgálat (RIA) segítségével volt meghatározható, a radíoimmun-vizsgálatával megegyező pontossággal, azonban lényegesen gyorsabban és biztonságosabban. A találmány még további célja olyan eljárás kidolgozása, amely antigének kvantitatív meghatározására szolgál, és nemcsak többértékű vagy polifunkciós antigének, hanem hiányos antigének, például a haptének meghatározására is alkalmas. A találmány további feladata eljárás biztosítása antitestek és/vagy antigének meghatározására, amelynek során az antigének és/vagy antitestek agglutinációja mellett azok gátló hatásait is kihasználjuk. Amint fentebb már említettük, a gyakorlatban egyáltalán alkalmazott ismert eljárás - amelynél az antitest vagy antigén segítségével érzékenyített latex-részecskéket antigént vagy antitestet tartalmazó mintával érinrkeztetve agglutinációt hoznak létre, és annak mértékét a folyadék zavarosságának csökkenési sebességével mérik — különböző hátrányokkal rendelkezik. Ilyen hátrány a meghatározás nem kielégítő pontossága és reprodukálhatósága, mivel a reakciót rendkívül híg latex alkalmazásával, stacionárius állapotban kell kivitelezni. További hátrány, hogy először el kell távolítani minden olyan szenynyező anyagot, amely a zavarosságot befolyásolhatja. Nyilvánvaló tehát, hogy abban az esetben, ha a mintában jelenlevő antigént és/vagy antitestet nagy pontossággal és jó reprodukálhatósággal kívánjuk meghatározni, az antigénnel vagy antitesttel érzékenyített oldhatatlan hordozót, például a latex-részecskéket lehetőleg nagy koncentrációban kell a meghatározni kívánt mintával érintkeztetnünk, amely olyan antigént és/vagy antitestet tartalmaz, amely reagálni képes a hordozón jelenlevő antitesttel vagy antigénnel, hogy ezáltal meggyorsítsuk az antigén-antitest reakciót. Emellett a reakciót előnyösen a reakcióelegy mozgatása közben, nem pedig stacionárius állapotban kellene kivitelezni. Azt találtuk, hogy az oldhatatlan hordozórészecskéken lehetőleg nagy koncentrációban jelenlevő antitest vagy antigén és a mintában jelenlevő megfelelő antigén vagy antitest közötti reakció nem-stacionárius körülmények közötti kivitelezése során és a reakció lejátszódása mértékének egyidejű kvantitatív kimutatásakor különösen kedvező eredményeket kapunk, ha legfeljebb 1,6 mikrométer átlagos részecskeátmérőjű, oldhatatlan hordozót alkalmazunk, az antigén-antitest reakciónál képződő elegyet 0,6—2,4 mikrométer hullámhosszúságú fénynyel besugározzuk, ahol az alkalmazott fény hullámhossza 1,5-10-szerese a hordozórészecskék átlagos átmérőjének, és mérjük az elegyen áthaladt fény intenzitását. A találmány alapját az a felismerés képezi, hogy az antigén-antitest reakció lejátszódásának mértéke, az érzékenyített, oldhatatlan hordozórészecskék jelenlétében, nagyon pontosan arányos az elegyen átbocsátóit fény intenzitásával. Az antigén-antitest reakció lejátszódásának mértéke a mintában jelenlevő antitest és/vagy antigén mennyiségével vagy koncentrációjával is arányos, feltéve, hogy a reakció meghatározott körülmények között megy végbe. A találmány szerint ezért úgy végezzük az antigének és antitestek meghatározását, hogy valamely antitestet vagy antigént, célszerűen antifibrinogént, anti(humán chorion-gonadotropin)-t, humán chorion-gonadotropint, oxitocint, anti(humán immunglobulin E)-t, aníi(humán immunglobulin G)-t, anti(humán immunglobulin M)-t, anti(sertés inzulin)-t, anti(humán chorion-gonadotropin)-béta-alegységet, humán gamma-globulint vagy anti(humán alfa-fetoprotein)-t, legfeljebb 1,6 mikrométer átlagos átmérőjű oldhatatlan hordozórészecskékhez rögzítünk, és ezáltal az oldhatatlan hordozórészecskéket érzékenyítjük, a hordozón jelenlevő antitestet és/vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
