176250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 12ß-hidroxikardenolid-származékok mikrobiológiai előállítására
V .0.50 10 hidrogénatom vagy hidroxil-csoport, Y jelentése hidrogénatom, R jelentése II, III, IV vagy V képletű csoport - kardenolidot Streptomyces purpurascens KA—26 (MNG 179) vagy Streptomyces purpurascens KA—43 (MNG 178) vagy Streptomyces purpurascens KA—82 (MNG 177) vagy Streptomyces purpurascens KC—157 (MNG 176) vagy Streptomyces alboniger AB-318-ST (MNG 180) törzsek (letétbe helyezve az Országos Közegészségügyi Intézet Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében) süllyesztett tenyészetével fermentálunk, és az átalakított terméket vagy termékeket a fermentléből önmagában ismert módon elkülönítjük. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitelezése érdekében legfontosabb szempont az aszeptikus körülmény k mindenkori biztosítása. A Streptomyces törzseket a sugárgombák tenyésztésére általánosan alkalmazott körülmények között növesztjük. Erőteljes > növekedést kapunk szén- és energiaforrásként mindazon cukrokat alkalmazva, amelyeket a törzsek jól hasznosítanak, így pl. glükóz, arabinóz, xilóz, mannit, fruktóz, szacharóz vagy raffínóz használata esetén. Nitrogénforrásként mogyorólisztet, kukoricalekvárt, peptont, előnyösen szójalisztet, kazeint vagy ezek hidrolizátumát, aminosavakat és szervetlen ammóniumsókat használhatunk. A táptalaj pH-ját 6 és 8 közé, előnyösen pH = 7-re állítjuk, és pufferkapacitásának növelésére alkalmazhatunk kalcium-karbonátot. Az esetleges habzás elkerülésére célszerű már a sterilezés előtt a táptalajhoz növényi olajat — előnyösen pálma, illetve napraforgóolajat - vagy szintetikus habzásgátlót adni. A táptalaj sterilezését 30-60 percen át 120 °C-on, 1 atni. túlnyomáson végezzük. A tenyésztést és az átalakítást a Streptomycesek számára kedvező 30-40 °C-on, előnyösen 32 °C-on célszerű végrehajtani, de alkalmazhatunk a növesztés során 32 °C-ot az átalakításkor pedig 37 °C-ot. Lényeges, hogy a teljes folyamat alatt megfelelő levegőcserét biztosítsunk a süllyesztett tenyészetben, amit a lombikok rázatásával, illetve a fermentorokon átáramoltatott steril levegő megfelelő mértékű keverésével érünk el. A szubsztrátum átalakítását erőteljesen kinőtt tenyészettel, előnyösen 1% körüli szárazanyag-tartalom elérése esetén indíthatjuk, de lehetséges azt a tenyésztéssel egyidőben is végezni. Adagoláshoz a szubsztrátumot vízzel elegyedő, az átalakítást nem gátló oldószerben oldva juttatjuk a fermentlébe, az oldatot előzetesen szűréssel vagy hővel sterilezve. A szubsztrátum adagolását előnyösen a 2 034 353 számú Nagy-Britannia-i közrebocsátási iratban - mely megfelelő oldószer kiválasztásával lehetővé teszi a fermentlére számolt szubsztrátum-koncentráció jelentős növelését is - leírt módon végezhetjük. Az átalakítás előrehaladását az időközben kivett minták rétegkromatográfiás elválasztása után a kardenolid-tartalom dixantilkarbamiddal képzett színének fotometrálásával ellenőrizhetjük. A fermentálást akkor fejezzük be, amikor az analitikai vizsgálat a szubsztrátum elfogyása mellett a kívánt tennék maximális felszaporodását jelzi. Ekkor a fermentlevet szűrjük, és a képződött terméket a sejtmasszából, illetve a fermentléből szerves oldószerrel extraháljuk. Az extraktum szárazmaradékát kromatografálással, illetve átkristályosítással tisztítjuk. A találmány szerinti eljárás fő előnye, hogy két egymást követő mikrobiológiai átalakítás helyett egyetlen fermentációs lépésben teszi lehetővé a primer 12-dezoxikardenolidok átalakítását szekunder 12/3-hidroxil-csoportot tartalmazó kardenoliddá. Az egyik fermentációs lépés kiesése egyben a költséges és anyagveszteséggel járó extrahálási-feldolgozási művelet megtakarítását is jelenti. Ennek következtében egyszerűbben és lényegesen jobb hatásfokkal állítható elő 120-hidroxikardenolid. Nagy jelentősége van annak is, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazásával nincs szükség a drog feldolgozásakor - a primer glükozidok szekunder glükoziddá alakításának elősegítésére — energia igényes szárításos fermentálásra. Az eljárás birtokában a növény termesztési körülményei miatt változó glükozid összetételétől - az összglükozid-lanatozid-C arány értékéből - függetlenül biztosítható a g^ógyászatilag legfontosabb digoxin előállítása. A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy alkalmazásával nemcsak a lanatozid -, hanem a purpurea-glükozidok is átalakíthatok gyógyászatilag hasznos termékké. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük: A példákban szereplő glükozidok minőségi és mennyiségi meghatározását az alábbiak szerint végeztük: A glükozidok minőségi meghatározására rétegkromatográfiát alkalmaztunk: Kieselgél HF2S4 (Merck, Darmstadt, Német Szövetség) Köztársaság) 0,25 mm vastagságú, 20 x 20 cm-es rétegen futtattunk telített gőzterű Desaga kádban, a primer glükozidok esetén kloroform-metanol, 90 :10 rendszerben (1), a szekunder glükozidok esetén etilacetát - ciklohexán - abszolút etanol, 55 :35 :10 rendszerben (2), valamennyi esetben háromszor fejlesztve ki a kromatogramot. A vizsgálandó mintából annyit vittünk a rétegre, hogy a felcseppentett térfogat 10—50 /ug mennyiséget tartalmazzon az egyes glükozidokból. Azonosításhoz a meghatározandó minták mellett standard referens glükozidokat futattunk. A kromatogramot ánizsaldehides reagenssel, illetve A. Waldi klóraminos reagensével [Arch. Pharm. 292. : 206 (1959)] hívtuk elő. Az ánizsaldehides reagenssel (500 ml 99,6%-os ecetsavban 3 ml ánizsaldehid és 4 ml koncentrált kénsav) a réteget átnedvesítésig egyenletesen lepermeteztük majd 110°C-on 10 percig melegítettük. A kromatogramon az egyes glükozidok jellemző színnel jelentek meg (1.4. táblázat). A Waldi féle reagenssel előhívott kromatogramon a glükozidok UV lámpa alatt jellemző színnel fluoreszkálnak (E. Stahl, Dünnschicht-Chromatographie. Springer Verlag, 1967. 344. old.). A glükozidok Rf, Rj/lanatozid A-ra illetve digitoxinra vonatkoztatott) adatait, illetve az ánizsaldehides reagenssel adott színeit a 4. táblázatban adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
