176250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 12ß-hidroxikardenolid-származékok mikrobiológiai előállítására
11 176250 12 4. táblázat Ánizsaldehides Primer glükozidok Rf Rf (lanatozid A) reagenssel adott szín lanatozid A 0,26 1 szürkéskék lanatozid A 0,13 0,5 kék purpurea A 0,09 0,35 szürkéskék Szekunder glükozidok Rf Rf (digitoxin) digitoxin 0,61 1 szürkéskék digoxin 0,43 0,7 kék 7/3-hidroxi-digoxin 0,34 0,56 ibolyás kék acetil-digitoxin 0,78 1,27 szürkés kék acetil-digoxin 0,55 0,90 kék A kvantitatív meghatározás a vékonyrétegkroma- 20 nátriumhidroxid adagolással 7,5 és 8,0 közötti +ográfiával elválasztott glükozidok dixantilkarbamiddal adott színreakcióján alapszik. A kromatogramot jódgőzben előhiva, a foltokat a standard glükozidoknak megfelelően bejelöltük, majd a jódot az adszorbensről légáramban elszublimáltattuk, hogy az adszorbens teljesen kifehéredjék. A bejelölt foltokat csiszoltdugós kémcsövekbe kapartuk, és 4 ml dixantilkarbamidos reagenst [H. Pötter : Pharmazie 20. 737 (1965)]mértünk rájuk. Alaposan összerázva a kémcsöveket 3 percre 100 °C-os vízfürdőbe helyeztük. Szobahőmérsékletre való hűtés után a felrázott szuszpenziót élesre fugáltuk. A tiszta felülúszó színintenzitását 535 nm-en mértük glükozidokat nem tartalmazó oldattal szemben. A glükozidot nem tartalmazó oldatot az illető glükozid foltjának magasságában, az azzal azonos területű, de glükozidot nem tartalmazó „üres” foltnak a rétegről való lekaparásával a fent leírt módon készítettük. Az egyes glükozidok koncentrációját a mért extinkcióból a mindenkori hígítás és a felvitt térfogat figyelembevételével, a standard koncentrációgörbéből kapott szorzószám segítségével számítottuk tó. 25 30 35 40 értéken tartva. Ezután a szuszpenziót centrifugáltuk, és a felülúszót porlasztva szárítottuk. Az így készült termék a porszója, 9% nitrogén-tartalommal. A beoltott táptalajt tartalmazó lombikot percenként 300 fordulatszámú, 2,5 cm kilengésű síkrázógépen két napig 32 °C-on rázattuk, majd a tenyészethez 0,5 ml dioxánban oldott 50 mg lanatozid-A sterilre szűrt oldatát adtuk. Adagolás után a lombikot még négy napig ugyancsak 32 °C-on rázattuk, majd a tenyészetet 2 x 50 ml kloroformmal extraháltuk. Az extraktum glükozid tartalmát a fentiekben megadott módon meghatározva 12 mg digoxint találtunk. 2. példa Az 1. példában leírtak szerint eljárva, de a tenyészethez lanatozid-A helyett 1 ml dimetilszulfoxidban oldott 50 mg acetildigitoxint adagolva 9 mg digoxin képződött. 3. példa 1. példa Streptomyces purpurascens KA—43 (MNG 178) jelű törzs 3—4 hetes burgonyás-dextrózos ferdeagaron 50 nőtt tenyészetéről 10 ml steril vízzel szuszpenziót készítettünk. A szuszpenzió 1 ml-ével oltottunk 500ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100 ml PS-jelű táptalajt. A PS táptalaj összetétele: 55 0,8% porszója 3,0% glükóz pH = 7,0 sterilezés előtt. 45 percig 120°C-on sterileztünk. A táptalajhoz a glükózt 50%-os oldatban külön sterileztük 30 percig 120 °C-on. Porszója készítés: 0,4 mm fonaltávolságú szitán átszitált, extrahált szójadarából csapvízzel készült 10%-os szuszpenziót egy órán át 1 atm túlnyomáson hővel majd 37 °C-ra lehűtve 0,4% pankreatinnal két órán át keverés közben hidrolizáltunk, a pH-t 65 Az 1. példában leírtak szerint eljárva, de a tenyészethez lanatozid-A helyett 1 ml tetrahidrofurfurüalkoholban oldott 50 mg purpurea-glükozid A-t adagolva 8 mg digoxin képződött. 4. példa Az 1. példában leírtak szerint eljárva, de a tenyészethez lanatozid-A helyett 1 ml dimetilszulfoxidban oldott 50 mg digitoxint adagolva 8 mg digoxin képződött. A meghatározás szerint 15 mg digitoxin átalakulatlan maradt. 5. példa Mindenben az 1. példában leírtak szerint jártunk el, de a szuszpenziót az 1. lombiknál Streptomyces purpurascens KA-26 (MNG 179), a 2,. lombiknál 6
