176133. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és szer az MB-kreotinkináz aktivitásának meghatározására testfolyadék- mintákban
17 176133 18 ciót adunk be, ezt további három hét múlva megismételjük, majd 19 nap múlva vért veszünk az állatoktól. A feldolgozás a B) példa a) szakaszában leírt módon történik. így liofilizált alakban kapjuk a sertés-izom MM-kreatinkináz-antitesteket, amelyek molekulasúlya körülbelül 160 000 és 180 000 között van. Teljesen egyező módon állítjuk elő a marha-izom MM-kreatinkináz-antitesteket szarvasmarha-izomszövetből. Az így kapott marha-izom MM-kreatinkináz-antitestek molekulasúlya szintén körülbelül 160 000 és 180 000 között van. 6. példa III. vizsgálat MB-kreatinkináz aktivitásának mennyiségi meghatározására testfolyadékokban A vizsgálati csomag 1 palackban 30 meghatározáshoz elegendő puffer-szubsztrát-oldatot és 30 palack koenzim-enzim-antitest elegyet tartalmaz. A vizsgálatnál a komponensek a következő töménységben vannak : 100 mM trietanolamin-puffer, pH-értéke 7,0 35 mM kreatin-foszfát 20 mM glükóz 9 mM glutation 10 mM magnézium-acetát 1 mM ADP (adenozin-difoszfát) 0,6 mM NADP (nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát) 10 mM AMP (adenozin-monofoszfát) >1200 egység/1 glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz > 1200 egység/1 hexokináz 800 egység/1 kecskében termelt, emberi MM-kreatinkinázt gátló antitest. 1 palack koenzim-enzim-antitest elegyhez 2 ml puffer-szubsztrát oldatot és 0,1 ml friss és nem hemolizált szérumot pipettázunk, az oldatot összekeverjük és 7 percig 25 °C-on állni hagyjuk. Ezután 5 percenként mérjük az extinkció növekedését; a hullámhossz 334, 365 vagy 340 rim, a rétegvastagság 1 cm. Volumenaktivitások kiszámítása: 334 nm-nél: AE/5 perc x 1359 [egység/1] 340 nm-nél: AE/5 perc x 1333 [egység/1] 365 nm-nél : AE/5 perc x 2400 [egység/1]. 7. példa IV. vizsgálat az MB-kreatinkináz mennyiségi meghatározására testfolyadékokban A vizsgálati csomag 1 palack, 25 meghatározáshoz elegendő (185 ml) puffer oldatot, 25 palack koenzim-enzim-antitest elegyet és 5 palack kreatin-foszfátot (indító reagenst) tartalmaz. A vizsgálatnál a komponensek a következő töménységben vannak : 100 mM imidazol-acetát puffer, pH-értéke 6,7 30 mM kreatin-foszfát 20 mM glükóz 20 mM N-acetil-cisztein 10 mM magnézium-acetát 2 mM EDTA (etilén-diamin-tetraacetát) 2mM ADP 2 mM NADP 5 mM AMP 10 jxM adenozin(5')-pentafoszfo-(5')adenozin =£ 1500 egység/1 glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz S2500 egység/1 hexokináz 1000 egység/1 kecskében termelt, emberi MM-kreatinkinázt gátló antitest 1 palack koenzim-enzim-antitest elegyhez 2,5 ml puffer-oldatot adunk (1. oldat); egyidejűleg kreatin-foszfátból (indító reagensből) 1 palack tartalmát 1 ml pufferben feloldjuk (2. oldat). Az 1. oldat 2,5 ml-éhez 0,1 ml szérum-mintát pipettázunk, az oldatot összekeverjük és 10 percig 25 °C-on állni hagyjuk. Ezután a 2. oldatból 0,1 ml-t hozzáadunk, az oldatot újra összekeverjük és 2 percig 25 °C-on állni hagyjuk. Ezt követően 5 percen keresztül, percenként mérjük az extinkció növekedését. Hullámhossz: 334, 365 és 340 nm, rétegvastagság 1 cm. A B-kreatinkináz alegység volumenaktivitásának kiszámítása : 334 nm-nél: AE/percx4369 [egység/1] 340 nm-nél : AE/perc x 4286 [egység/1] 365 nm-nél: AE/percx7714 [egység/1]. A B-kreatinkináz alegységek aktivitását 2-vel megszorozva kapjuk az MB-kreatinkináz aktivitását a mintában. A következő értékeknél nagy valószínűséggel szívizomkárosodás áll fenn : Teljes kreatinkináz-aktivitás: > 160 egység/1 MB-kreatinkináz-aktivitás: > 10 egység/1 MB-kreatinkináz részaránya: > 6% Nagy valószínűséggel vázizom-károsodás történt, ha az MB-kreatinkináz részaránya kisebb 6%-nál. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás az MB-kreatinkináz izoenzim-hibrid aktivitásának testfolyadék-mintákban MM-kreatinkináz (izom-kreatinkináz) jelenlétében történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy állatokat SH-csoportokat stabilizáló és aktiváló anyagokkal, célszerűen N-acetil-ciszteinnel, merkapto-etanollal, ditio-eritrittel, glutationnal, ciszteinnel, ditio-treittel és/vagy S-(2-amino-etil)-izotiurónium-bromid-hidrobromiddal aktivált emberi MM-kreatinkinázzal beoltunk és a képződött antitesteket izoláljuk, a mintát kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében az így kapott antitestekkel inkubáljuk, amelyek az MM-kreatinkináz- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M-alegységének enzim-aktivitását teljesen gátolják anélkül, hogy ugyanakkor az adott esetben jelenlevő MB-kreatinkináz B-alegységének enzim-aktivitását inaktiválnák, majd az inkubálást követően a mintában az MB-kreatinkináz B-alegységének aktivitását kreatinkináz-szubsztrátumok hozzáadása után, arra alkalmas 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
