176133. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és szer az MB-kreotinkináz aktivitásának meghatározására testfolyadék- mintákban
15 176133 16 metán-hidroklorid pufferoldatban, amely 0,01 mól kálium-kloridot, 1 millimól etiléndiamin-tetraecetsavat és 1 millimól ditio-eritritet is tartalmaz, szuszpendáljuk és kev'erőkészülékben homogenizáljuk. Az így kapott homogenizátumot jéggel történő hűtés közben 45 percig keverjük, majd 60 percig centrifugáljuk 12 000g-nél (itt g a gravitációs gyorsulási faktort jelenti). A centrifugálás után kapott 2,680 liter tiszta szupernatáns folyadékot 8,0 pH-értéknél ammónium-szulfáttal történő frakcionálásnak vetjük alá, 45—75%-os telítettségi fokú oldatokkal. A 75%-os telítettségnél kapott csapadékot 0,04 mól trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid pufferoldattal (pH=8,0) felvesszük és ugyanilyen pufferoldattal szemben dializáljuk. A mioglobin és a savanyú ballaszt-fehérjék adszorbeáltatása céljából 500 g nedves, bázisos ioncserélőt (térhálósított dextrán, az említet pufferoldattal egyensúlyba hozva) adunk hozzá. 30 percig állni hagyjuk, majd az ioncserélőt szívatással kiszűrjük és 400—400 ml 0,04 mólos trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid pufferoldattal (pH=8,0), amely 0,02 mól nátrium-kloridot is tartalmaz, kétszer mossuk. A szűrletet az így kapott mosófolyadékokkal egyesítjük és ammónium-szulfáttal 75%-os telítettségre hozzuk. A képződött csapadékot centrifugálással elkülönítjük, 100 ml 0,04 mólos trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid pufferoldatban (pH=8,0) oldjuk és ugyanezzel a pufferoldattal szemben dializáljuk, mindaddig, míg ammónium-szulfát már nem mutatható ki az oldatban. A kapott tiszta dializátumot egy 6 x 60 cm méretű, térhálósított dextrán-alapú bázisos ioncserélőt (ugyanezzel a pufferoldattal egyensúlyba hozva) tartalmazó oszlopra visszük. Az oszlopot a kezdeti pufferoldattal mindaddig mossuk, míg az eluátum fehérje-mentes nem lesz. Ezután az enzimet 0,04 mólos, 8,0 pH-értékű, 0,02 mól nátrium-kloridot, 1 millimól etiléndiamin-tetraecetsavat és 1 millimól ditio-eritritet is tartalmazó trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid pufferoldattal eluáljuk az oszlopról. A legalább 20 E/ml enzimet tartalmazó frakciókat egyesítjük, ammónium-szulfáttal 80%-ig telítjük és az így kicsapott enzimet centrifugálással elkülönítjük. A kapott enzimet azután végső tisztítás céljából még egyszer kromatografáljuk ugyanebben a rendszerben, de kisebb térfogatú oszlopon. Az egyesített aktív frakciókból azután az enzimet 80%-os telítettségű ammónium-szulfát-oldattal kicsapjuk, 50 ml 0,04 mólos, 8,0 pH-értékű, 0,02 mól nátrium-kloridot, 1 millimól etiléndiamin-tetraecetsavat és 1 millimól ditio-eritritet is tartalmazó trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidrokloríd pufferoldatban oldjuk, oly mennyiségű pufferoldatot alkalmazva az oldáshoz, hogy koncentrált enzim-oldatot kapjunk, ezt sterilre szűrjük és ammónium-szulfáttal ismét 80% telítettségi fokig telítjük. Ily módon egy 4 °C hőmérsékleten stabil MM-kreatínkináz-enzim-szuszpenziót kapunk, amelynek kreatinnal, mint szubsztrátummal, 25 °C hőmérsékleten mért fajlagos aktivitása 26—30 E/mg. A kapott termék térfogata 86 ml; aktivitása 316 E/ml; fehérjetartalma 11,8 mg/ml; a szerv-kivonatra számított hozam: körülbelül 30%. b) A fenti a) szakaszban leírthoz hasonló módon különíthető el az MM-kreatinkináz-enzim állatok, például Rhesus-majom, sertés vagy szarvasmarha izomszöveteiből is. B) Anti-MM-kreatinkináz-előállítása aj Az emberi izomból nyert MM-kreatinkináz-izoenzimet 0,07 mólos trietanol-amin-oldattal tompított, 7,0 pH-értékű fiziológiás konyhasó oldattal szemben, amely 10 millimól merkapto-etanolt és 10 millimól magnézium-kloridot is tartalmaz, dializáljuk. Az enzimoldatot ultracentrifugálással mentesítjük az aggregátumoktól, fehérjetartalmát pedig az említett dialízis-pufferrel 2mg/ml-re állítjuk be. Az így kapott oldat 1 ml-ét 1 ml komplettírozott Freund-féle adjuvánssal (2 mg elölt M-tuberkulózis-bacilust tartalmazó vízásványolaj-szuszpenzió) emulgeáljuk. A kapott emulziót egy kecskének adjuk be intramuszkuláris injekcióban. Három további ugyanilyen injekciót adunk be az állatnak háromhetes időközökben, majd három Boosterinjekciót, 16—16 hetes időközökben, azután az utolsó injekciót követő 21. napon vért veszünk az állattól. E vérből az ismert módszerrel nyert szérum pH-ját 3% juh-szérum-albumint és 0,1% nátrium-azidot 0,1 mólos borát-pufferoldatban tartalmazó eleggyel 8,4 értékre állítjuk be, majd sterilre szűrjük. Az így kapott oldatot, amely humán izom anti-MM-kreatinkinázt tartalmaz, 0,5 ml-es adagokban barna üvegpalackokba töltjük és liofilizáljuk. A kapott antitestek molekulasúlya körülbelül 160 000 és 180 000 között van. b) Az a) szakaszban leírt módon kapott humán-izom MM-kreatinkináz-oldatot egy 0,1 mól imidazollal tompított, 6,8 pH-értékű, 7,5 millimól N-acetil-ciszteint és 25 millimól magnézium-acetátot is tartalmazó fiziológiás nátrium-klorid-oldattal szemben dializáljuk. Ezután az enzim-oldatot ultracentrifugálással mentesítjük az aggregátumoktól, fehérjetartalmát pedig az említett dialízis-pufferoldattal 0,2mg/ml-re állítjuk be. Az így kapott oldat 1 ml-ét 1 ml komplettírozott Freund-féle adjuvánssal emulgeáljuk. Az így kapott emulziót intradermális injekcióban egy ürünek adjuk be. Ezt követően 3 és 6 hét múlva két további intramuszkuláris injekciót adunk be ugyanebből az injekcióból, majd további három Booster-injekciót adunk be az állatnak, 14—14 hetes időközökben. Az utolsó injekció után 19 nappal vért veszünk az állattól és ezt a B) példa a) szakaszában leírthoz hasonló módon dolgozzuk fel. Így liofilizált alakban kapjuk a humán-izom anti-MM-kreatinkinázt A kapott antitestek molekulasúlya körülbelül 160 000 és 180 000 között van. c) Rhesus-majom-izomból nyert MM-kreatinkináz-izoenzimet egy 0,15 mól imidazollal tompított, 6,8 pH- értékű, 25 millimól ditio-eritritet és 15 millimól mangán(II)-kloridot tartalmazó fiziológiás nátrium-kloridoldattal szemben dializálunk. Az aggregátumokat ultracentrifugálással eltávolítjuk, a fehérjetartalmat pedig az említett dialízis-pufferoldattal 5 mg/ml-re állítjuk be. Az így kapott oldat 1 ml-jét 1 ml komplettírozott Freund-féle adjuvánssal emulgeáljuk. Az injekciók beadása, a vérvétel és a feldolgozás a B) példa a) szakaszában leírt módon történik. így liofilizált alakban kapjuk a Rhesus-majom-izom MM-kreatinkináz-antitesteket. A kapott termék szedimentációs állandója körülbelül 7 S. d) Sertés-izomból kapott MM-kreatinkináz-izoenzimet a B) példa b) szakaszában leírt módon aktiválunk és a kapott antigén-emulziót (komplett Freund-féle adjuvánssal emulgeálva) nyulaknak adjuk be injekcióban. Három hét múlva egy további szubkután antigén-injek5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
