176133. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és szer az MB-kreotinkináz aktivitásának meghatározására testfolyadék- mintákban
176133 több sáv mutatkozik, mini ahány izoenzim jelen-'van (artefaktumok). 2. Kromatografálás különféle adszorbensekkel töltött oszlopokon; ilyen eljárást például Mercer D. W. Clin. Chem. 20, 36—40 (1974) ismertet. Ez a módszer hosszadalmas, több órai tényleges munkaidőt Igényéi és f uf ifivizsgálatokra nem alkalmas. A különböző vizsgálatok eredményei gyakran ellentmondóak. 3. Immunológiai meghatározás lecsapó antitestekkel. Ezt a módszert a 21 28 670;és 22 58 822 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi közrebocsátási iratok ismertetik ; ez a módszar jó eredményeket nyújt például az aldoláz és alkalikus; foszfatáz izoenzimek menynyiségi meghatározásában^ A kreatinkináz viszonylag csekély aktivitásának meghatározására — különösen az MB-kreatinkináz-izoenzim;esetében — azonban ennek 1 a módszernek az érzékenysége nem elegendő. Valamennyi említett eljájás emellett hosszadalmas és körülményes, a kivitelezés Sok időt igényel és ezért különösen a szívinfarktus gyors diagnosztizálására téljéséff alkalmatlan. ' A'találmány célkitűzését tehái az a feladat képezte, hogy egy egyszerű, reprodukálható és gyorsan kivitelezhető eljárást és ehhez alkalmas szert dolgozzunk ki az MB-kreatinkináz-aktivitásnak a testfolyadék mintáiban történő meghatározására. Ezt a feladatof azálfaröIdöTíuk meg, hogy egy eddig' ismeretlen eljárást bocsátunk rendelkezésre, amely spe, delçfçik'.’ÿZfl^a ^jecifikus’antitestek teljesen gátolják az M-alegység enzimatikus aktivitását az MM- és MB-kreatinkináz-izoeniimekbeá • anélküT, hogy egyidejűleg gátolnák az esetleg jelenlevő MB-kreatinkináz-izoenzim B-alegységének az enzimatikus aktivitását is. A találmány tárgya tehát új eljárás az MB-kreatinkináz-izóenzim ak tivitásának test folyadék-mintákban történő meghatározására, amelÿét áz jellemez, hogy a mintát kreatinkináz-szübsztrátüfhók jelenlétében olyan antitestekkel inkubáljúk, atfielyék áz MM-kreatinkináz- és MB-kreatinkináz-izoenziníek M-alfegységének enzimaktivitását teljesen gátolják, anélkül, hogy ugyanakkor az adott esetben jelenlevő MB-kreatinkináz B-alegységének enzim-aktivitását inaktiválnák, és amelyek úgy állíthatók elő, hogy állatokat az SH-csoportokat stabilizáló és aktiváló anyagokkal, célszerűen N-acetil-ciszteinnel, merkapto-etanollal, ditio-eritrittel, glutationnaí, ciszíéinriel, ditio-treittel, és/vagy S-(2-amino-etil)-izotiuróniüm-bromid-hidrobromiddal aktíváit emberi MM-kreatinkifiázzal beoltunk és a képződött antitesteket izoláljuk, majd az irikubálást követően a mintában az MB-kreatinkináz B-alegységének aktivitását kreatinkináz-szubsztrátumok hozzáadása Után, erre alkalmas segédreakciókat követő fotometriás méréssel meghatározzuk. A találmány további tárgya egy ugyancsak új szer az MB-kreatinkináz-izoenzim aktivitásának testfolyadékmintákban történő meghatározására, amelyet az jellemez, hogy olyan antitesteket tartalmaz, amelyek az MM-kreatinkináz- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M- alegységénçk enzim-aktivitását teljesen gátolják, anélkül^ hogy ugyanakkor áz ádoit esetben jelenlevő MB- kreatinkináz B-'alegyáégértek enzim-aktivitását inaktiválnák, és amelyek úgy állíthatók elő, hogy állátokat az SH-csoportokat stabilizáló és aktiváló anyagokkal, célszerűen N-acet il-ciszteinnel, merkapto-etanollal, ditio»eritrittel, glutationnal, ciszteinnel, ditio-treittel, és/vagy %-(Í9ámifeo-etil)-izotiurónium-bromid-hidrobromiddal áktiváltemberi MM-kreatinkinázzal beoltunk és a képződött antitesteket izoláljuk, és amely antitestek kreatin- 5 kináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljes gátlást tudnak kifejteni. E szer egyik előnyös kiviteli alakját az jellemzi, hogy az abban jelenlevő antitestek 2500 egység/liter koncentrációig képesek a meghatározandó mintában gátolni az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzi- 10 mek M-alegységének az enzjmatikus aktivitását. A találmány szerinti szer előnyösen alkalmazható az MB-kreatinkináz-izoenzim aktivitásának az MM-kreatinkináz-izoenzim jelenlétében történő meghatározására, valamint diagnosztikai segédeszközként különösen a 15 szívizom-infarktus, és/vagy a szívizom más megbetegedéseinek illetőleg sérüléseinek a diagnózisára. Jól alkalmazhatók továbbá e szerek a kreatinkináz-Összaktivitásnak & az MB-kreatinkináz-aktivitásnak a testfolyadékmintákban egyidejűleg történő meghatározására. 20" Testfolyadékként a találmány-szerinti eljárásban elsősorban a humán-szérum jön tekintetbe. Tekintetbejöhet azonban más testfolyadék is, mint például a teljes emberi vér, plazma, vizelet, köpet vagy verejték, valamint analóg állati testfolyadékok is. A találmány szerinti el- 25 járás kivitelezése sarán a BB-kreatinkináz jelenléte zavarja a meghatározást és ezért ennek az izoenzimnek .........nenrszabadjeleirfeimie-a-vizsgálandó-testfolyadékban. A találmány szerinti eljárás lefolytatásához szükséges -, ( antitesteket állatokból nyerhetjük, MM-kreatinkináz- 30 -antigénekkel történő beóltás írtján. Antigénként erre a célralkúlőpösígi emberi MM-kreatinkináz alkalmas. Alkalmazható azonban állati MM-kreatinkináz is, ha az ezzel előállított antiszérumok teljesen gátolni képesek az M alegység enzimatikus aktivitását az emberi 35 MM-kreatinkináz és MB-kreatinkináz izoenzimekben, adott esetben kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is. Az MM-kreatinkináz-antigének szolgáltatására alkalmas állatokként elsősorban a különböző majomfajták, különösen a Rhesus-majmok és csimpánzok, továbbá 40 háziállatok, mint sertés, ló, szarvasmarha, nyúl, tengerimalac, valamint egyéb állatok, mint patkány, egér, valamint madarak, mint liba, kacsa vagy tyúk jönnek tekintetbe. Az antitestek előállítására felhasználásra kerülő 45 MM-kreatinkináz-antigénnek mentesnek kell lennie az MB- és BB-kreatinkináz-aktivitástól. Ennek a tisztasági követelménynek érzékeny kritériumát nyújtja az előnyösen diffúziós vagy elektroforézises módszerrel végzett immunológiái analízis. Emellett jól alkalmazhatók 50 korong-elektroforézises és poliakrilamidgél-elektrofókuszálási analitikai módszerek is. E módszerek alkalmazása során elsősorban az MB és BB-kreatinkináz-izoenzimek esetleges jelenlétének kimutatása az elsődleges. Emellett kevésbé fontos a másfajta fehérjék esetleges 55 jelenléte, ami a két legutóbb említett analízis módszerrel szintén megállapítható. A kreatinkináz-izoenzim-típusok mikroheterogenitása, amely például az egyes izoenzimek aminosav-Összetételében mutatkozó csekély különbségekben nyilvánulhat meg, tisztasági követel- 60 ményként általában nem játszik szerepet. Immunizálás céljaira olyan állatokat alkalmazunk, amelyek az aktivált MM-kreatinkináz-antigénekkel történő beoltás után az MM- és MB-kreatinkináz M alegységének enzimatikus aktivitását teljesen gátló antitestek 65 képzésére képesek, anélkül hogy az így képezett anti-2
