176133. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és szer az MB-kreotinkináz aktivitásának meghatározására testfolyadék- mintákban
5 176133 6 testek egyidejűleg gátolnák az esetleg jelenlevő MB-kreatinkináz B alegységének enzimatikus aktivitását is. Erre a célra különösen a kecskék alkalmasak. Tekintetbejöhetnek azonban más állatok is, különösen gerinces állatok, például majom-fajok, lovak, szarvasmarhák és hasonlók, juhok, kutyák, sertések, nyulak, madarak, mint tyúk, pulyka, liba és kacsa, továbbá patkányok, egerek és tengeri malacok. A kecskék különösen az olyan antitestek indukciójára alkalmazhatók, amelyek kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljesen gátolni képesek az MM- és MB-kreatinkináz M alegységének az aktivitását. A kísérleti állatok immunizálását a találmány értelmében aktivált emberi vagy állati MM-kreatinkinázzal végezzük. Az MM-kreatinkináz aktiválása ismert reagensekkel történik, amelyek az SH-csoportokat stabilizálják és aktiválják és/vagy kétértékű fémionokkal ; különösen pedig az említett reagensek és fémionok kombinációi alkalmasak erre az aktiválásra. SH-csoportokat stabilizáló és aktiváló reagensekként előnyösen például N-acetil-cisztein, merkapto-etanol és ditio-eritrit, továbbá glutation, cisztein, ditio-treit, S-(2-amino-etil)-izotiurónium-bromid-hidrobromid (AET) és/vagy tioglikolsav alkalmazhatók.. Kétvegyértékű fémionként különösen a magnézium, továbbá a mangán, kalcium és/vagy kobalt vízben oldódó sóiból, például kloridokból vagy acetátokból származó ionok alkalmasak. Az ilyenfajta aktiválási módszerek elvileg már ismeretesek más területekről és kivitelezésük a szakember számára nem jár nehézséggel. Az immunizálás további lefolytatása és az antiszérumokká, illetőleg antitestekké történő feldolgozás ismert módon történik. A kapott antiszérumok illetőleg antitestek további feldolgozása és tárolása ugyancsak az immunológiában jól ismert módszerekkel történhet. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható antitestek főként az IgG-immunglobulin-osztályba (bivalens antitestek) sorolhatók. Molekulasúlyuk körülbelül 130 000 és 210000 közé esik, előnyösen 160000 körül van; ülepedési állandójuk megközelítőleg 6 S és 8 S között, előnyösen 7 S körül van; szénhidrát-részük az összsúly körülbelül 3%-át teszi ki. Az említett IgG-antitestdc mellett egyvegyértékű IgG-fragmensek (=Fab) és IgM-antitestek is alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban. A találmány értelmében alkalmazásra kerülő antitesteknek teljesen gátolniok kell a kreatinkináz M alegységének az enzim-aktivitását. A „teljes gátlás” alatt itt oly mértékű gátlást értünk, amely mellett legfeljebb 5 egység/liter, előnyösen legfeljebb 3 egység/liter mértékig marad meg a mintában jelenlevő MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének az enzim-aktivitása. További követelmény, hogy az antitestek ne befolyásolják az MB-kreatinkináz-izáenzim B alegységének az enzim-aktivitását. Ezen azt kell érteni, hogy a mintában jelenlevő MB-kreatink ináz-izoenzim B- alegységének legfeljebb 10 egység/liter, előnyösen legfeljebb 5egység/Kter része legyen gátolva. A- találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja esetében, amely abból áll, bogy a vizsgálandó testfolyadék-urintát és. az. antitesteket kreatmkiaáz-szubsztrátumok jelenlétében inknháyuk;,az antitesteknek még azzal a; tukydoosággal is readdtemiük kell, hogy az MM- és Mi^kraiinkináz-izoenziraek M alegységének enzim-aktivitását gátló hatásukat kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljesen ki kell fejteniök, anélkül, hogy ugyanakkor befolyásolnák az esetleg jelenlevő MB-kreatinkináz-izoenzim B alegységének enzim-aktivitását is. Ez a tulajdonság fennáll például az olyan antitestek esetében, amelyeket kecskékből nyertünk teljesen aktivált MM-kreatinkináz-izoenzimmel történő immunizálás útján; ugyanakkor az ilyen antitestek rendelkeznek a fentebb említett egyéb követelményeket kielégítő tulajdonságokkal is. A találmány szerinti eljárás szokásos kiviteli módja (először inkubálás antitestekkel, majd a kreatinkináz-szubsztrátum hozzáadása és fotometriás mérés) esetében azonban az utóbb említett különleges tulajdonság nem feltétlen követelmény. Kreatinkináz-szubsztrátumként bármely, a szokásos módon alkalmazásra kerülő szubsztrátum illetőleg effektor alkalmazható. A találmány szerinti eljárás esetében elsősorban kreatin, kreatin-foszfát, adenozin-difoszfát, adenozin-trifoszfát és magnézium-ionok jönnek erre a célra tekintetbe. A kreatinkináz és izoenzimjei aktivitásának illetőleg maradék-aktivitásának a meghatározása elvileg bármely ismert, gyorsan és pontosan kivitelezhető eljárással történhet. Alkalmasak erre a célra, például az olyan ismert eljárások, amelyek lehetővé teszik, a kreatinkináz-aktivitásnak kreatinkináz-szubsztrátumok hozzáadása után, segédreakciókat követő fotometriás meghatározással történő mérését. Erre a célra kolorimetriás módszerek jöhetnek tekintetbe, amilyeneket például a „Methoden der enzymatischen Analyse” című mű 1. kötete (H. U. Bergmeyer, 3. kiadás, 1974) a 145. és következő oldalakon ismertet. Különösen előnyösek azonban az olyan kinetikai módszerek, amelyek során az enzimaktivitást az ibolyántúli tartományban, például 334, 340 vagy 366 nm-nél végzett spektrofotometriás méréssel határozzák meg. így elsősorban például az a standard-módszer alkalmazható, amellyel a kreatinkinázt kreatin-foszfát és adenozin-difoszfát alkalmazásával határozzák meg (Z. Kl in. Chem. Kiin. Biochem., 8. köt. 658. és köv. old., 1970; 10.5.182. old., 1972). A kreatinkináz-aktivitás e módszerrel történő meghatározására szükséges segédanyagok egységcsomagokban szerezhetők be a kereskedelemben. Egy másik ismert meghatározási módszer esetében fluorometriás úton határozzák meg a kreatinkináz-aktivitását. Kreatinkináz segítségével a kreatin-foszfátból kreatin szabadítható fel, amelyet azután R. B. Conn — Clin. Chem. 6. köt. 537. és köv. old. (1960) — eljárása szerint, ninhidrinnel erősen alkalalikus oldatban történő reagáltatás útján fluorometriásan határoznak meg; vő.: Sax és munkatársai, Clin. Chem., 11. köt. 951. és köv. old. (1965). A találmány szerinti eljárás egy célszerű kiviteli módját az alábbiakban részletesen szemléltetjük: A vizsgálandó testfolyadék-mintához, előnyösen humán-szérum-mintához olyan mennyiségben adunk MM-kreatinkináz-antitesteket, amennyi elegendő ahhoz, hogy az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimekben az M-alegység aktivitását 2500 egység/liter, előnyösen körülbelül 1000 egység/liter szintig teljesen gátolja. Nagyobb kreatinkináz összaktivitású testfolyadékok esetében a tényleges meghatározás lefolytatása előtt a mintát célszerű körülbelül 1000 egység/liter aktivitásig hígítani. Ezt az előzetes hígítást azután figyelembej kell venni a meghatározás eredményeinek kiszámítása során. A min5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
