176068. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a biológiailag aktív heparin meghatározására plazmában
3 176068 4 II. AT I1I+ - - nzirü enzim-AT III++enzim (felesleg) (maradék) enzim III. Tos-Gly-Pro-Arg-pNA-----------► Tos-Gly-Pro(maradék)-Arg-OH -f-p-nitro-anilin (A + jel aktiválást jelez.) Fölös mennyiségű AT III normálplazma vagy tisztított AT III formájában való hozzáadásával az ezen eljárás szerint végzett heparinmeghatározás messzemenően független a plazmamintában levő AT III-tól. így a mintában jelenlevő összes heparint meghatározzák, amely az AT líf-on át trombin, illetve Xa-faktor inaktiválására képes. Azt találtuk azonban, hogy ennek a rendszernek a következő hátrányai vannak : a páciensplazmákban nem ritkán előforduló AT III-hiány a hozzáadott AT III miatt nem vehető észre. Olyan extrém, de a klinikai gyakorlatban mindazonáltal előforduló esetben, ha a páciens plazmájában gyakorlatilag nincs AT III, egy egyedüli heparinterápia hatástalan lenne. A heparin semmilyen biológiai hatást nem gyakorolhatna már a trombinra. Az orvos így eszerint a tesztelv szerint hamis képet kapna a páciens véralvadási képességéről. Következésképpen a heparinmeghatározáshoz kiegészítésképpen egy AT III meghatározást is kell végezni. A találmány feladata ezért olyan eljárás kidolgozása, amely alkalmazásával heparin biológiai aktivitása közvetlenül meghatározható. Ezt a feladatot a találmány szerint a plazmában levő heparin biológiai aktivitásának meghatározására szolgáló olyan eljárással oldjuk meg, amelynek során egy proteolitikus enzimet és ennek egy kromogén szubsztrátját adjuk hozzá a rendszerhez, és a kromogén szubsztrátból felszabaduló színezéket mérjük; proteolitikus enzimként trombint vagy Xa faktort alkalmazunk, és a meghatározást antitrombin III hozzáadása nélkül végezzük. Az irodalomban található adatok szerint tisztított AT III hozzáadásával a heparinmeghatározás érzékenysége annyira megnövekszik, hogy kis (10 egység/liter) heparinmennyiségek is meghatározhatók lesznek. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával meglepő módon az is lehetséges, hogy AT 1(1 hozzáadása nélkül is kielégítő érzékenységgel mérjünk a plazmában kis koncentrációtartományban, normál AT III szint esetén. A meghatározás például 37 °C-on 20 USP/liter plazmakoncentrációnál még kielégítő pontossággal elvégezhető. Mivel a vizsgálati rendszerhez külön AT Ill-t nem adunk hozzá, a trombin inaktiválás biológiai mechanizmusának megfelelően mindkét paramétert, a heparint és az AT Ill-t is értékelhetjük. A mintában levő AT III-on keresztül a heparin, amelyet a mintában meghatározunk, kifejtheti biológiai aktivitását a trombin inaktiválása formájában. Ez az eljárás a páciens véralvadási állapotának közvetlen ellenőrzési lehetőségét biztosítja az orvosnak a heparinterápia során. A proteolitikus enzim kromogén szubsztrátjai alatt általában olyan szubsztrátokat értünk, amelyekből az enzim hatására színezék hasad le. Ez a spektrum látható tartományában meghatározható színezék, valamilyen fluoreszcens színezék vagy ultraibolya tartományban meghatározható valamilyen színezék. Előnyös kromo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 gén szubsztrátok olyan peptidek, amelyek egy argininrész karboxilcsoportján amidkötéssel kapcsolódó színezéket tartalmaznak. Különösen alkalmas a p-nitro-anilid-csoport, valamint ebből szubsztitúcióval lese/ethető hasonló színezékek. Kapcsolódhatnak azonban az argininrész karboxilcsoportjához más aminocsoporttartalmú színezékek is. Trombin alkalmazása esetén szubsztrátként előnyösen Bz-Phe-Val-Arg-pNA-t, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA-t vagy Tos-Gly-Pro-Arg-pNA-t használnak. Xa faktor alkalmazása esetén előnyösen Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA-t használnak kromogén szubsztrátként. Az eljárás körülményei pH-érték, idő, hőmérséklet és hasonlók tekintetében lényegében megfelelnek az ismén eljárásoknál alkalmazottaknak. Előnyösen pH 8,0-nál és trisz(hidroxi-metil)-amino-metán/sósav pufferrel dolgozunk. Más puflerrendszerek, így például trisz(hidroxi-metil)-amino-metán/imidazo! vagy imidazol/sósav pufferek is alkalmazhatók. A meghatározást célszerűen szobahőmérsékleten végezzük. Végezhető azonban a meghatározás magasabb (30-tól 37 C-ig terjedő) hőmérsékleten is, ahol magasabb trombinaktivitásnak megfelelően kisebb enzimkoncentrációkat adunk hozzá. A vizsgálati elegyben optimális ionerősség elérése céljából a pufferoldathoz sókat, előnyösen alkálifémkloridokat, így nátrium-kloridot vagy kálium-kloridot adunk hozzá. A plazmamintában levő zavaró idegen proteázaktivitások csökkentésére előnyösen aprotinint alkalmazunk. A találmány tárgyát képezi továbbá a plazmában levő heparin meghatározására szolgáló reagens is, amely lényegében 0,01—0,3 mól/liter 6—9 pll-jú puffert, 0,01—0,25 mól/liter alkáli-kloridot, 200—1100 egység/liter trombint vagy Xa faktort, 0,05—10 mmól/liter kromogén szubsztrátot, 0—0,01 g/liter aprotinint, 0—0,03 mól/liter etilén-diamin-tetraecetsavat és 0—10 /gliter poli-etilén-glikolt tartalmaz. A trombin, illetve Xa faktor mennyiségénél megadott egységek (a továbbiakban is) a National Institut of Health (NIH) definíciói szerinti egységek. A találmány szerinti eljárás és reagens előnye, hogy a vizsgálat kivitelezéséhez egy komponenssel kevesebb szükséges, mint az ismert eljárásokhoz. Következésképp a vizsgálat manuális elvégzése egyszerűbb. Az eljárás azonban mindenekelőtt analizáló automatákra való alkalmazást illetően előnyösebb. Továbbá, az AT III- hozzáadás elhagyása rendkívül kedvezően hat a meghatározás költségeire. A normálplazma valamint a tisztított AT III hozzáférhetősége korlátozó faktort jeleni. Az eljárás lényeges előnyeként említendő az alkalmazó részére a klinikán megnövekedett vizsgálati kapacitás. Az eljárás kivitelezhető kinetikusán, amikor a trombin-kiindulási aktivitás reakciósebessége és a trombinmaradék aktivitás reakciósebessége közvetlenül a szubsztráttal való reakció megindítása után szolgálnak mérési értékül. Alkalmazható továbbá a végérték-eljárás is, amelynél bizonyos mérési idő után a reakciót savval, például ecetsavval, való pH-eltolással leállítják. A teszt-keverék például a következőket tartalmazza: 0,045 mól/liter 8,0 pH-értékű trisz/sósav puffer, 0,14 mól/liter nátrium-klorid, 0,01 mól/liter etilén-diamin-tetraecetsav, 2
