176068. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a biológiailag aktív heparin meghatározására plazmában

176068

6

5

9 g/Iiter poli-etilén-glikol,

0,01 g/liter aprotinin,

300 egység/liter trombin,

0,14 mmól/liter Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.

Példa:

Az alább leírt példát a kinetikus eljárás szerint a következő reagensek alkalmazásával valósítjuk meg:

1. reagens:

0,05 mól, liter 8,0 pH-értékű trisz/sósav puíTer,

0,15 mól/liter nátrium-klorid,

0,01 mól/liter etilén-diamin-tetraecetsav,

10 g/liter poli-etilén-glikol,

0,01 g/liter aprotinin,

330 NIH/liter trombin.

2. reagens:

1,5 mmól/liter Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.

Meghatározási körülmények :

Mérési hullámhossz: Hg 405 nm; a küvetta rétegvastagsága: 1 cm; inkubációs hőmérséklet : szobahőmérséklet.

A küvettába 2,0 ml 1. reagenst pipettázunk, hozzáadunk 0,02 ml mintát, és összekeverjük. Az clegyet 3 percig 25 °C-on inkubáljuk, utána hozzákeverünk 0,2 ml 2. reagenst. Azextinkciót 3 percig regisztráljuk 25 °C-on.

Mérési sorozatonként egy vakpróbát kell végezni. Itt a plazmaminta helyett vizet adunk a rendszerhez.

Kiértékelés:

Megállapítjuk a különbséget a vakpróbánál 3 percen át mért extinkcióváltozás és a mintánál 3 percen át mért extinkcióváltozás között. Ez a különbség a plazmában levő heparin biológiai aktivitásának mértéke. Éppígy használható a 3 perc múlva mért abszolút extinkció a kiértékeléshez, amint az 1. ábrán ábrázoljuk. Ez az 1. ábra 18 plazmamintára kapott eredményeket mutat, amelyekhez mért mennyiségű heparint adtak, úgyhogy 0,05-től 1,0 USP heparin/ml plazma közötti koncentrációtartományt fog át.

A reagens összetétele a következő :

0,01—0,3 mól/liter 6—9 pH-értékü puffer,

0,01—0,25 mól/liter nátrium-klorid,

0. 001.0,03 mól/liter etilén-diamin-tetraecetsav,

5 200—1100 egység/liter trombin,

'0,05 mmól/liter szubsztrát,

0—0,01 g/liter aprotinin és 0—10 g/liter poli-etilén-glikol.

10

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás plazmában levő heparin biológiai aktivitásának meghatározására protcolitikus enzim és kromo-15 gén szubsztrátjának hozzáadásával és a kromogén S7ubsztrátból felszabaduló színezék mérésével, emellett kromogén szubsztrát ként előnyösen olyan pepiid alkalmazásával, amely egy argininrész karboxilcsoportjához. amidkötésscl kapcsolódó p-nitro-anilid-csoportot tar- 20 talmaz és protcolitikus enzimként, trombin alkalmazása esetén szubsztrátként előnyösen Bz-Phe-Val-Arg-pNA, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA vagy Tos-Gly-Pro-Arg-pNA, illetve protcolitikus enzimként Xa faktor alkalmazása esetén kromogén szubsztrátként előnyösen Bz- 25 Ile-Glu-GIy-Arg-pNA alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy protcolitikus enzimként trombint vagy Xa faktort alkalmazunk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a vizsgálati clegyhez aprót ininl

30 is adunk.

3. Reagens plazmában levő heparin 1. igénypont szerinti meghatározására, azzal jellemezve, hogy

0,01—0,3 mól/liter 6—9 pH-értékű puffért,

0,01—0,25 mól/liter alkálifém-kloridot,

35 200—1100 egység/liter trombint vagy Xa faktort,

0,05—10 mmól/liter kromogén szubsztrátot,

0—0,01 g/liter aprolinint,

0—0,03 mól/liter etilén-diamin-tetraecetsavat,

0—10 g/liter poli-etilén-glikolt 40 tartalmaz.

1 db ábra

A kbdácéft Met: a Kfo*»rd««á*i<• Jogi Könyvkiadó icazpldj» 81.943.6642 Alföldi Nyomd», Debrecen — Feleld» yexafr. Beokd tevén i—ntfd

3