176046. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,6-diszubsztituált-9-(ß-D-arabinofuranozil)-purin- 5'-foszfátok, gyógyászatilag elfogadható sóik és ilyen vegyületeket tartalmazó vírusellenes gyógyászati készítmények előállítására
7 176046 8-5'-foszfátot és 55 egység AMP diaminázt 10 ml teljes térfogat eléréséhez elegendő mennyiségű vízben tartalmazó elegyet 25 °C-on 24 órán át állni hagyunk. A reakcióelegyet azután szűrjük és a szűrletet 100 ml térfogatra hígítjuk. A nukleotidokat aktív faszénen adszorbeáljuk, majd 25 ml 10%-os vizes piridin-oldattal eluáljuk. Az eluátumot beszárítjuk 30 °C-on, csökkentett nyomáson. A kapott port feloldjuk 25 ml vízben, szűrjük és liofilizáljuk, amikor 30 mg 2-amino-6-hidroxi-9-(ß-D-arabinofuranozil)-purin-5'-foszfátot kapunk. Ultraibolya spektruma 0,1 n sósav-oldatban felvéve: Xmax 255 és 276 mm(váll.)-nál, míg 0,1 n nátriumhidroxid-oldatban : Xmax 258 nm és Xmin 231 nm. 3. példa 2-Hidroxi-6-amino-9-(ß-D-arabinofuranozil)-purin-5'-foszfát (Ara-izo-GMP; I általános képlet R2=OH) A serratia marcescens-ből nyert részben tisztított foszfortranszferáz készítményt használunk fel a cím szerinti vegyületnek a 2-hidroxi-6-amino-9-(ß-D-arabinofuranozil)-purin-ból (ara-izo-G) kiinduló szintetizálására. Az ATCC 14 327 számon letétbe helyezett Serratia marcescens törzset Difco táptalajon tenyésztjük a stacioner állapot beállásának kezdetéig és centrifugálással végezzük a begyűjtést. A sejteket egy „francia sajtóval” 1360 atm nyomáson összetörjük és a kapott szuszpenziót 5000 g gyorsulással 15 percen át centrifugáljuk a sejttörmelék eltávolítása céljából. Miután a felülúszó fázist ribonukleázzal és dezoxiribonukleázzal kezeljük, a szuszpenziót 100 000 g gyorsulással centrifugáljuk két órán át. A csapadékot ismét szuszpendáljuk 0,1%-os Triton X-100-ban, ultrahanggal rázatjuk és 100 000 g gyorsulással centrifugáljuk két órán át. A felülúszó folyadékfázist Amicon ultraszűrő membrán felhasználásával koncentráljuk, így biztosítva, hogy a 100 000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulák fennmaradjanak a szűrőn. Látszólag a membrán minden enzimet visszatart. A nyers extraktumra számítva 50%-os átlagos enzim kihozatalt és négyszeres tisztulást érünk el. Egy 2 ml térfogatú, 300 mmól nátriumacetát puffert (pH 4), 1 mmól rézszulfátot, 220 mmól p-nitrofenil-foszfátot, valamint 16 mmól 2-hidroxi-6-amino-9-(p-D-arabinofuranozil)-purin (ara-izo-G)-t tartalmazó reakcióelegyet és a fenti enzim készítménynek egy 10 mg proteint tartalmazó adagját 27 °C-on, 3 napon át inkubáljuk, centrifugáljuk és a szupematánst liofilizáljuk. A liofilizált port feloldjuk vízben és felvisszük egy 1 cm átmérőjű, 60 cm hosszú Bio-Rad P-2 poliakrilamid gél oszlopra. A vízzel eluált nukleotid frakciókat összegyűjtjük, liofilizáljuk és felvisszük egy cellulózból készült vékonyréteg lapra, amely Uniplate Avicel F néven kerül kereskedelmi forgalomba és 1000 jjl vastagságú. A lemezt n-propanol—víz 7: 3 arányú elegyével hívjuk elő. A nukleotidnak megfelelő sávokat vízzel eluáljuk a cellulóz lapról és liofilizáljuk. A liofilizált port feloldjuk vízben és felvisszük egy 0,9 cm átmérőjű, 100 cm hosszú, vízzel egyensúlyi állapotba hozott Sephadex G-10 kromatográfiás oszlopra, majd vízzel eluáljuk. A nukleotidot tartalmazó fiakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk, amikor 2-hidroxi-6-amino-9-( ß-D-arabinofuranozil)-purin-5'-foszfátot kapunk fehér por alakjában, 2 mg-nyi mennyiségben. A termék cellulóz vékonyréteg kromatográfiás mérés során egyetlen foltot ad. Ultraibolya spektruma megegyezik az izoguanidin arabinozid spektrumával, tehát 0,1 n sósav-oldatban mérve Xmax 235 (váll.), 282 nm, Xmin 248 nm, pH 7 esetén Xmax 247, 288 nm; Xmin 232, 263 nm; 0,1 n nátriumhidroxid X nax 250, 281, 320 (váll.) nm; Xlnin 237, 262 nm; a bázis foszfáthoz viszonyított aránya 1: 1,1; és 5'-nukleotidázzal kezelve izoguanin-arabinoziddá hasad. 4. példa (Nem tartozik a találmány oltalmi körébe.) 2.6- Dihidroxi-9-(ß-D-arabinofuranozil)-purin-5'-foszfát (Ara-XMP) 20 ml reakcióelegyet, mely 25 mmól trisz-hidroximetil-ammóniumkloridot (pH 8,0) 100 mmól káliumkloridot, 0,4 mmól NAD+-t (NAD=koenzim I), 15 mmól pirosszőlősavat, 10 mmól 6-hidroxi-9-(ß-D-arabinofuranozil)-purin-5'-foszfátot (ara-IMP), 15 mg laktát dehidrogenázt és 35 milliegység IMP-dehidrogenázt (IMP=hipoxantin-ribozid-5-foszforsav) tartalmaz, 24 órán át inkubálunk. További 25 milliegység IMP dehidrogenázt adunk az elegyhez és az inkubálást további 24 órán át folytatjuk (tehát a teljes inkubálás ideje 96 óra lesz). A reakcióelegyet szűrjük és liofilizáljuk. A liofilizált port feloldjuk minimális mennyiségű vízben és felvisszük egy vízzel kiegyenlített 2,5 cm átmérőjű, 90 cm hosszú Bio-Rad P-2 poliakrilamid gél oszlopra. Az oszlopot vízzel eluáljuk, és az ultraibolya fényt abszorbeáló frakciókat összegyűjtjük, felvisszük egy DEAE A-25 Sephadex oszlopra és Caldwell módszere szerint [J. Chromatography, 44, 331 (1969)] kromatografáljuk, 4,7-es pH-értékű trietilammónium-acetát puffer felhasználásával. Az ara-XMP-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, liofilizáljuk, amikor 1,2 mg 2,6-dihidroxi-9-(ß-D-arabinofuranoziI)-purin-5'-foszfátot kapunk fehér por formájában. Ultraibolya spektrum 0,1 n nátriumhidroxid-oldatban felvéve: X nax 248, 276 nm-nál, XMP aminázzal egy a 2- -amino-6-hidroxi-9-( ß-D-arabinof uranozil)-purin-5'-foszfátból (ara-GMP) vett összehasonlító mintával azonos termékké alakítható. 5'-nukleotidázzal ara-X-é tehát 2,6-dihidroxi-9-( (i-D-arabinofuranozil)-purinná hasítható. 5. példa 2.6- Diamino-9-(ß-D-arabinofuranozil)-purin-5'--foszfát nátriumsó (annak az I általános képletű vegyületnek a nátriumsója, melyben R2=NH2) 1 mmól 2,6-diamino-9-(ß-D-arabinofuranozil)-purin-5'-foszfátot (I általános képlet, R2=NH2) feloldunk 0,1 n nátriumhidroxid-oldat 10 ml-ében, majd liofilizálunk, amikor a 2,6-diamino-9-(ß-D-arabinofuranozil)-purin-5'-foszfát-mono-nátriumsót kapjuk, kvantitatív kihozatallal. A kémiai analízis eredmények és az ultraibolya spektrum igazolják, hogy a cím szerinti vegyületet kaptuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
