175585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklodextrin-glükozil-transzferáz enzim előállítására
3 175585 4 Az ilyen módon készített (rögzített ciklodextrin) termékből kromatográfiás oszlopot készítünk és a Bacillus macerans felhasználásával nyert fermentlevet az oszlopon átfolyatjuk. Az oszlopon átfolyó oldatban ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzimaktivitást kimutatni nem lehet. Ugyanakkor a hidrolitikus enzimek (melyek aktivitását ß-hatärdextrinnel specifikusan mérjük) és egyéb szennyezések változatlanul átfolynak az oszlopon. A ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzim kötődése az alábbi egyensúlyi reakcióval írható le: A—CHA+E^A—CHA • • • E ahol: A—CHA az agarózhoz kötött ciklodextrint E a ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzimet A—CHA • • • E pedig az enzim és a hordozó között kialakult hidrogénkötéses kapcsolódás révén létrejött komplexet jelenti. A komplex disszociációs állandója méréseink szerint 15 °C-on Ks=3,8xlO-3 M/liter, a komplexképzés szabadenergia-változása pedig AG=3210 kal/mól. A kapcsolódás jellege lehetővé teszi az oszlopon megkötődött enzim egyszerű visszanyerését is. így a közölt disszociációs állandónak megfelelő, vagy annál nagyobb szabad ciklodextrin-koncentrációjú oldattal kis térfogatban visszanyerhető az enzim. A visszanyerés megoldható az enzim térszerkezetének reverzibilis megváltoztatásával is, például: 5 mólos karbamid oldattal, vagy pH-eltolással. A Bacillus macerans felhasználásával nyert fermentlében található hidrolitikus enzimek olyan nagy disszociációs állandóval kötődnek csak a rögzített ciklodextrin molekulákhoz, hogy a kialakult komplex létezését mérésekkel bizonyítani sem lehet, így azok lemosódnak az oszlopról. Egyéb szennyező anyagok pedig egyáltalán nem kötődnek. A rögzített ciklodextrint tartalmazó gél kapacitása rendkívül nagy, 1 ml gélágyon 100—1000 ml fermentlé enzimtartalma köthető meg (a termelt enzimaktivitástól függően). A megkötött és visszanyert enzim mennyisége körülbelül 500 mg/ml gélágy; a fermentlé fehérjetartalmára vonatkoztatott tisztulás (113-szoros) egyetlen lépésben eléri az előzőekben közölt soklépéses eljárásnál kapott tisztulást, több mint 90%-os hozammal. A találmány szerinti eljárás további előnyös sajátsága az, hogy segítségével nemcsak elő lehet állítani a szenynyező anyagoktól és egyéb hidrolizáló enzimektől mentes állapotban a ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzimet, hanem ezt könnyen kivitelezhető, egylépéses tisztítással lehet elérni, sőt az eljárás segítségével egyúttal a tisztításon túl egy, mintegy 50—200-szoros töményítés is bekövetkezik. A fermentléből az enzimet mintegy 90%-os kitermeléssel lehet a találmány szerinti eljárással elkülöníteni. A találmány szerinti eljárással előállított, hidrolizáló enzim mentes ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzimmel az enzimatikus hidrolízis okozta veszteségek elmaradása következtében mintegy 20%-kal javítható a kitermelés a szokványos módon előállított enzimpreparátumokkal elérhető konverziófokhoz képest. Tekintettel arra, hogy a ciklodextrin gyűrűje mintegy 1% redukáló cukor tartalomnál felnyílik, az ilyen fermentlevek feldolgozása csak előzetes dialízis után történhet. Minthogy azonban a szokásos fermentlevekben a redukáló cukor tartalom legfeljebb 0,01—0,025%, ez a veszély a gyakorlatban nem áll fenn, amit az a tapasztalatunk is bizonyít, hogy a gél kapacitása többszöri felhasználás esetén sem csökken. Eljárásunk további részleteit a találmány korlátozásának szándéka nélkül a következő kiviteli példák világítják meg közelebbről. 1. példa Enzimkinyerés fermentléből A felhasznált, Bacillus macerans alkalmazásával nyert fermentlé jellemző adatai: 110 Kitahata által definiált enzim egység ml-enként; a 280 nm-en mért extinkció (ennek jelölése: OD280)=11,2; fajlagos aktivitása: 9,8 egység/OD280. Redukáló cukortartalma glükózban kifejezve: 0,02%. A Kitahata szerinti enzimaktivitás mérési módszere [Agr. Biol. Chem., 38, 387. (1974)] 4,5 ml 0,55%-os oldható keményítő-oldathoz 0,5 ml enzim-oldatot adnak, 40 °C-on 10 percig inkubálják, majd 0,5 ml mintát 4,0 ml 0,01 mólos jód-oldathoz mérnek és az oldatot 20 ml-’-e feltöltve 660 nm-en fotometrálják. Egy enzimegység a fényáteresztés 1%-os csökkenése 1 perc alatt. A kromatografáló oszlop ágy térfogata: 1,6 x 6,0 cm. A töltet Sepharose-6B-ből a korábbiakban megadott irodalom szerint készült a-ciklodextrin kapcsolásával. Kapac tása mintegy 10 jiM ciklodextrin/g nedves gél. Az en; im megkötése az oszlopon: a csapvízzel hűtött oszlop a 100 ml/óra sebességgel visszük fel a fenti fermentle/et. 2000 ml felvitele után az oszlopot desztillált vízzel kimossuk, majd 80 ml 5 mólos karbamid-oldattal kioldjuk az enzimet. Párhuzamos kísérletben a kioldást 80 ml1 %-os «-ciklodextrin-oldattal és 9,2 pH-jú foszfátpuffén :1 is elvégezzük. A kioldással nyert enzim-oldat adatai 160 000 Kitahata enzimegység/80 mg fehérjetartalo n : 144 OD2go/80 ml ; fajlagos aktivitása 1111 egység/OI »280. Az ( szlop desztillált vizes kimosásánál kapott mosófolyadi k aktivitása : 60 000 egység, mely ciklodextrinszintetizáló aktivitással nem rendelkezik, csak hidrolitikus aktivitása van. 2. példa Ciklodextrin konverzió tisztított enzimmel Példánkban összehasonlítjuk a ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzim-preparátumot és a tisztítatlan a-amilázt tartalmazó Bacillus macerans fermentlé szűrletet biokonverziós eljárással. 100 ml 30 súlyszázalékos, előzetesen zselatinizált kukoricakeményltő-oldathoz — melyet előzetesen Bacillus subtilis eredetű a-amilázzal parciálisán hidrolizáltunk oly mértékig, hogy a kapott degradátum 50 °C-on rotációs viszkoziméterrel mérve 250 cP viszkozitást mutasson — száraz kukoricakeményítő szubsztrát grammonként 4 Tilden—Hudson egységnyi (mintegy 12 Kitahata egység) ciklodextrin-glükozâtranszferâz enzimet adunk az előző példa szerint nyert, tisztított enzim-preparátumból („A” jelű konverzió minta). 5 m 15 20 25 [30 35 40 45 50 55 60 65 2
