175585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklodextrin-glükozil-transzferáz enzim előállítására
5 175585 6 A „B” jelű konverzió mintánál mindenben az „A” mintánál leírtak szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy a cíklodextrin-glükoziltranszferáz tartalmú tisztítatlan Bacillus macerans fermentlé szűrletet adjuk a konverzió szubsztráthoz. Az „A” és a „B” jelű mintákban a biokonverziót 5 térfogatszázalék toluol lecsapószer jelenlétében, 45 °C- on kevertetés mellett végezzük oly módon, hogy a toluol precipitánst az enzim-oldat hozzáadása után egy órával adagoljuk a kukoricakeményítő degradátum-ciklodextrin-glükoziltranszferáz konverzió elegyekhez. A konverziót 5 napig folytatjuk. A 3. és az 5. napon mintát véve meghatározzuk az össz-ciklodextrin, valamint a fí-ciklodextrin tartalmat. Eredményeinket a következő táblázat szemlélteti : Minta Keményítő súlyszázalék Enzimszubsztrát arány TH egység/g keményítő ß-ciklodextrin vegyes százalék össz-ciklodextrin vegyes százalék 3 nap 5 nap 3 nap 5 nap „B” 33 4 8,7 10,2 14,5 17,0 „A” 33 4 12,6 17,5 18,0 25,5 A ß-ciklodextrin-tartalom meghatározása úgy történik, hogy 5 ml konverziós elegyet 10 ml desztillált vízzel hígítunk, majd centrifugáljuk. A zömében redukáló maltooligoszacharidokat és a- illetve y-ciklodextrint tartalmazó felülúszót elöntjük, majd a leülepedett keményítőt és (j-ciklodextrin-toluol zárványkomplexet tartalmazó csapadékból a ß-ciklodextrint jól oldódó dimetilformamid-komplexe formájában 25 ml 2: 1 arányú dimetilformamid—etanol oldószer eleggyel extraháljuk. Az oldhatatlan amilóz degradátum-etanol komplexeket kicentrifugáljuk. A felülúszóból a ß-ciklodextrint fenol-kénsav reagenssel, Dubois és Gilles módszerével határozzuk meg [Anal. Chem. 28, 350. (1956)]. Az össz-ciklodextrin tartalmat oly módon határozzuk meg, hogy 10 ml konverzió elegyet 1 ml triklóretilénnel 5 percig homogenizátorban [15—18 000 ford/perc] kevertetünk, majd a mintát egy éjszakán át 5 °C-on tároljuk. Ezt követően gravimetriás üvegszűrőn leszűrjük és a légszárazra szárított szilárd anyag súlyát analitikai pontossággal lemérjük. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás amiláz mentes ciklodextrín-glükoziltranszferáz enzim Bacillus macerans törzsek alkalmazásával 5 nyert fermentlevekből történő kinyerésére, azzal jellemezve, hogy a Bacillus macerans törzsek alkalmazásával nyert, ciklocextrin-glükoziltranszferáz enzimet tartalmazó fermer tlevet hordozóhoz, előnyösen agarózhoz 1,4-bisz(2,3-e roxipropoxij-butánnal rögzített ciklojQ dextrinnel hozzuk érintkezésbe, majd a hordozóhoz rögzített ciklodextrinről a megkötött ciklodextrin-glükoziltranszfei áz enzimet leoldjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jelle nezve, hogy a hordozóhoz rögzített ciklodextrinből a fermentlével való érintkeztetés után, a 15 ciklodcxtrin-í'Iükoziltranszfcráz enzim leoldása előtt a meg nem kői ött szennyezéseket és a hidrolitikus enzimeket vizes mosással eltávolítjuk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Bacillus macerans 20 törzsek alkalmazásával nyert fermentlevet hordozóhoz rögzített ciklodextrinként agaróz-gélhez kovalensen kapcsolt ciklodextrinnel hozzuk érintkezésbe. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Bacillus 25 macerans törzsek alkalmazásával nyert, ciklodextrin-glükoziltrani zferáz enzimet tartalmazó fermentlének a hordozóhoz rögzített ciklodextrinnel való érintkeztetését 5,0 és 7,0 közötti pH-nál, 1,0%-nál kisebb redukáló cukor-tartalomnál és 0—25 °C közötti, előnyösen 10— 30 15 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hordozóhoz rögzített ciklodextrinről a megkötött ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzimet 0,1—1,0%-os ciklodextrinoldattal oldjuk le. 35 6. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hordozóhoz rögzített ciklodextrinről a megkötött ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzimet 2,0—5,0 mólos karbamidoldattal oldjuk le. 40 7. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a hordozóhoz rögzített ciklodextrinről a megkötött ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzimet 9,0—9,5 pH-jú puffer-oldattal oldjuk le. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 81.615.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató 3
