175575. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kanamicin-származékok előállítására
15 175575 16 máson tedesztilláljuk az oldószereket. Etanollal többször mossuk a maradékot, kevés vízben feloldjuk, és egy CG—50 ioncserélő gyantával (NH4+-fázis, 50 ml) töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 50 ml vízzel mossuk, majd 1 liter 0,1 normál ammónium-hidroxid-oldattal és 600 ml 0,2 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. 20 ml-es eluátum-frakciókat szedünk, és az A-(l) módszernél leírtak szerint analizáljuk. A vékonyrétegen Rf 0,50-nél ninhidrin-pozitív és bioaktív foltot adó 47—72. frakciót egyesítjük, az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, és a maradékot liofilizáljuk. Ily módon 258 mg (6'-Cbz-kanamicin A-ra számítva 52%) BB=K 25-öt nyerünk, olvadáspont: 183—187 °C. 3. példa l~N-[L-(—)-Y-Amino-a-hidroxi-butiril]-6'-N-metil-kanamicin A (BB—K 28) 750 mg 6'-N-metil-kanamicin A (BB—K 25) 30 ml 60%-os vizes tetrahidro-furánnal készült oldatához 525 mg N-Cbz-L-y-amino-a-hidroxi-vajsav-N-hidroxi-szukcinimid-észtert adunk. 500 mg 10%-os csontszenes palládium jelenlétében éjszakán át szobahőmérsékleten, atmoszferikus nyomáson hidrogénezzük a reakcióelegyet. Kiszűrjük a katalizátort, és csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert. Kevés vízben feloldjuk a maradékot, és egy OG—50 ioncserélő gyantával (NH47-fázis, 70 ml) töltött oszlopra visszük fel az oklatot. Vízzel mossuk az oszlopot, majd egymás után 850 ml 0,1 normál atnmónium-hidroxid-oldattal (az 1—43. számú csőbe 20 ml-es frakciókat szedünk), 1450 ml 0,2 normál ammónium-hidroxid-oldattal (a 44—115. számú csőbe 20 ml-es frakciókat szedünk), végül 100 ml 0,5 normál ammónium-hidroxid-oldattal (a 116—215. számú csőbe 10 ml-es frakciókat szedünk) eluáljuk. A vékonyrétegen (sznlikagél lemez, futtatóelegy: kló* roform—metanol—28%-os ammóniiam-hidroxid—víz 1 : 4 : 2 : 1 arányú elegye) Rf=0,17-nél bioaktív és ninhidrin-pozitív foltot adó 152—161. frakciót egyesítjük, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert, és a maradékot liofilizáljuk. Ily módon 149 mg (16%) BB—K 28-at nyerünk, olvadáspont: 187—189 °C (bomlik). IR-spektrum (KBr) vco 1650 cm-1. NMR (D20): 8 (ppm) : 2,70 (3H, s, N—CH3). Analízis C23H43N30,3.2H2C03 képletre: számított: C 39,52, N 7,03, N 9,23%, talált : C 39,26, H 6,69, N 9,69%, 39,00, 6,54, 9,20% A BB—K 11 típusú izomer (3"-N-acilezett izomer) nyomainak eltávolítása céljából réztetrammin-fázisú Amberlite CG—50 ioncserélő gyantán oszlopkromatografáljuk a BB—K 28-at. 73 mg BB—K 28-tat kevés vízben feloldunk, és egy CG—50 ioncserélő gyantával réztetrammin-fázis, 3 ml) töltött oszlopon kromatografáljuk az oldatot. Az oszlopot először 20 ml vízzel mossuk, majd 100 ml 0,2 normál ammónium-hidroxid-oldattal, végül 100 ml 1,0 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. 7 ml-es eluatum-frakciókat szedünk, és ezeket ninhidrin folt teszttel, korongos tartalmi meghatározási módszerrel (B. subtilis PCI 219 és Pseudomonas aeruginosa) szilikagél lemezen végzett vékonyréteg-kromatográfiával (S—110 jelű futtatóelegy, ninhidrin) analizáljuk. Rf=0,2-nél a 21—24. frakció ninhidrin-pozitív és (a P. aeruginosa törzzsel szemben) bioaktiv foltot ad. Ezeket egyesítjük, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert, így 30 mg kék porszerű anyagot nyerünk. Ezt a 30 mg kék színű maradékot kevés vízben feloldjuk, és egy CG—50 ioncserélő gyantával (NH4+-fázis, 3 ml) töltött oszlopra felvisszük. Az oszlopot 20 ml 0,2 normál ammónium-hidroxid-oldattal, majd 200 ml 0,5 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. 7 ml-es eluátum-frakciókat szedünk. A pozitív ninhidrid-tesztet adó 19—23. frakciót egyesítjük, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk róluk az oldószert, és a maradékot liofilizáljuk. így 20 mg tiszta BB—K 28-at nyerünk, olvadáspont : 187—189 °C (bomlik). 4. példa l-N-[L-(—)- ß-Amino-a-hidroxi-propkmil]-6’-N-rnetil-kanamicin A (BB—K 162) 218 mg (0,912 millimól) N-Cbz-L-izoszerin, 1,63 mg (0,912 millimól) N-hidnoxi-5-norbomén-2,3-dikaTboximid és 188 mg (0,912 millimól) diciklohexil-karbodiimid 10 ml tétrahidrofuránnal készült degyét éjszakán át 5 °C-on állni hagyjuk, majd leszűrjük. 441 mg (0,892 millimól) 6'-N-metil-kanamidn A 20 ml 50%-os vizes tetrahidro-furánnal készült oldatához adjuk a szűrletet, 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük az elegyet, majd csökkentett nyomáson kb. 2 ml térfogatig betöményltjük. A koneentrátumot egy Amberlite CG—50 ioncserélő gyantával (NH4+-fázis, 26 ml) töltött oszlopra viszszük fel. Az oszlopot 40 ml vízzel mossuk, majd 500 ml 0,1 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. 10 ml-es eluátum-frakciókat szedünk. A 11—16. frakciót egyesítjük, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert, így 231 mg N-acüezett termékhez jutunk. 0,3 normál ammónium-hidroxiddal végzett elúció révén 175 mg (40%) kiindulási anyagot (BB—K 25) nyerünk vissza. 130 mg 10%-os csontszenes palládiumot adunk az acél-szácma2ék 20 ml 50%-os vizes etanollal készült oldatához, és szobahőmérsékleten, atmoszferikus nyomáson hidrogénezzük az elegyet. Kiszűrjük a katalizátort, és a szerves oldószert tedesztilláljuk. Az Így nyert vizes oldatot CG—50 ioncserélő gyantával (NH4+-fázis, 25 ml) töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot egymás után 40 ml vízzel, 240 ml 0,1 normál aromónium-hidroxid-oldaöal, 500 ml 0,2 normál :ammónium-hidroxid-oldattal, majd 500 ml 0,4 normál ammónium-faidroxid-oldattal eluáljuk, 10 ml-es •eluátum-fraketókat szedünk. A bioaktív frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk róluk az oldószert, így 127 mg nyersterméket nyerünk. CG—50 (réztetrammin-fázis, 4 ml) ioncserélő gyantán, 200 ml 0,3 mórinál ammánium-hidro*id<oldattal, 300 ml 0,5 normál ammóniunnbidroxid-ddattal, végül 300 ml 1 áronnál .amiHÓniunHhidroxid-oldattal eiuálva, 10 ml-es >ohiétunHfiakciókat szedve újra jcramatogtafáljuk a nyersterméket. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
