175474. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás 12ß-hidroxil-csoportot tartalmazó kardenolid vegyületek előállítására mikrobiológiai úton
5 175474 6 ságos előállítására. Ez azért jelentős, mert a lanatozid-C-nek a Digitalis lanata növényből történő kivonásakor nagy mennyiségben marad vissza a gyógyászatiig értéktelen lanatozid-A, digoxin előállításakor pedig az ugyancsak értéktelen digitoxin a visszamaradó termék. A találmány szerinti eljárás segítségével ezekből az értéktelen melléktermékekből állíthatunk elő értékes szívglükozidokat. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat ismertetjük: 1. példa Streptomyces praecox MNG 127 törzs tenyésztését 28 °C-on 1% glükózt 0,2% kazamint 0,1% húskivonatot 0,00% lanatozid-A-t és 1,7% agart tartalmazó szilárd táptalajon végezzük. A kémcsőben ferdeagaron kinőtt tenyészet spóráit 5 ml desztillált vízben szuszpendálva használjuk a süllyesztett tenyészet oltására. Vattadugóval lezárt 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban kisterilezett 100 ml S jelű folyékony táptalajt, amely 2% szójalisztet, 3% glükózt és 0,5% kalciumkarbonátot tartalmaz, 1 ml spóraszuszpenzióval beoltunk. A táptalaj kémhatása sterilezés előtt pH 7. Ezt követően 25 percen át 120 °C-on sterilezünk. A sugárgomba tenyésztését 28 °C-on olyan rázógépen végezzük, amely percenként 300-as fordulattal, 2,5 cm-es kilengést végez. Két nap növekedés után a 100 ml sugárgomba tenyészethez 2 ml metanolban oldva 50 mg digitoxint adunk, és a tenyésztést 37 °C-on további rázatás mellett folytatjuk. A biokémiai reakció előrehaladását naponta kivett minták kloroformos extraktjának vékonyréteg-kromatográfiás analízisével vizsgáljuk. Kieselgel HF2 54 (Merck, Darmstadt, NSzK) rétegen ciklohexán : etilacetát : abszolút etanol (35 : 55 : 10) elegyét használjuk futtatórendszernek. Az átalakítási termék foltjait ecetsavas ánizsaldehid előhívoszer alkalmazásával tesszük láthatóvá 105°-on. A rétegkromatográfiás analízis alapján a digoxin keletkezés szempontjából legkedvezőbb időpontban, 90 óra eltelte után a fermentlé szívglükozid tartalmát olyan módon vonjuk ki, hogy 40 db rázott lombikból nyert 4 liter fermentléből centrifugálással az ülepedő alkatrészeket elválasztjuk, a csapadékot 500 ml metanolban extraháljuk, majd a metanolos oldatot szárazra pároljuk. A centrifugálással kapott felülúszót 3x3 liter kloroformmal extraháljuk. Az extraktumba a metanolos kivonat száraz maradékát is beoldjuk, majd nátriumszulfáttal szárítva a kloroformos oldatot 40°C-on vákuumban bepároljuk. A kapott olajos maradékot 10 ml 1:1 arányú kloroform-metanol keverékkel felvesszük, és 20 g oszlopkromatografálásra használt szilikagélre szárítjuk. A kromatografálást 70 x 4 cm-es oszlopon végezzük, száraz hordozón indulva, felszálló irányban. Az oldószerkeverék összetétele kezdetben ciklohexán : etilacetát : abszolút etanol 35 : 55 : 2,5, amit lineárisan 35:55:10 arányra módosítunk 1100 ml eluátum térfogat eléréséig. Ezután az oldószer arány változatlan marad. Az átfolyás sebessége a kezdeti 30 ml/órával szemben 20 ml/órára csökken. Az át nem alakult kiindulási anyag, a digitoxin a 960—1070 ml közötti frakciókban jelenik meg. Ezután az 1070—1150 ml közötti frakciókból a digoxint, az ezt követő frakciókból a 7/3-hidroxidigoxint nyerjük ki. A digoxint tartalmazó frakciókból —20 °C-on 2 nap alatt 330 mg nyers digoxin válik ki, tűs kristályok formájában. Az anyalúgot vákuumban bepároljuk, az olajos maradékot 5 ml kloroformban felvesszük, és addig csepegtetünk hozzá ciklohexánt, amíg kiválást tapasztalunk. Néhány csepp metanollal a zavarosságot megszüntetjük, és -20 °C-ra lehűtve az elegyet kristályosodni hagyjuk. Két nap alatt 140 mg kristályos digoxin keletkezik. A két nyers terméket 80%-os forró metanolban oldva átkristályosítjuk. 450 mg kristályos terméket nyerünk. Op.: 245—250°, [a]p0 =+10,8° (c = 1 %, piridin). IR (KBr): 3510, 3400, 3090, 1710, 1620, 1400, 1270, 860, 820 cm-1. A termék savas hidrolízisével nyert aglükon spektrumai: tömegspektrum: 390 (M4), 372 (30%), 354 (70%), 262 (42%) 219 (40%), 201 (100%), 147 (40%), 111 (41). NMR (dimetilszulfoxidban): 0,7 s (18 Me), 0,9 s (19 Me), 3,85 (3H), 4,05 s (140H), 4,2 d (30H), 4,6 d (120H), 4,9 s (21H), 5,8 s (22H) ppm (S). UV (tömény kénsavban) Xmax : 228, 217, 388 nm. A 70-hidroxi-digoxint tartalmazó frakciók bepárlási maradékát 80%-os metanolból átkristályosítva 175 mg kristályos terméket nyerünk. Op.: 210-217 °C. [a]é° =+16,1° (c = 1,,piridin). Savas hidrolízissel nyert 7/3-hidroxil-digoxigenin spektrumai: tömegspektrum: 403 (M+, 3%), 281 (36%), 278 (30%), 163, 145 (43%). IR (KBr): 3570, 3370, 2910, 1600, 1430, 1310, 860, 825 cm'1. NMR (dimetilszulfoxidban): 0,7 d (18 Me), 0,9 s (19 Me), 3,9 (3H), 4,25 d (30H), 4,65 d (120H), 4,9 s (21H), 5,3 s ( 140H), 5,5 d (70H), 5,8 s (22H) ppm (Ô). UV (tömény kénsavban) Xmax : 230, 280, 460 nm. 2. példa A Streptomyces praecox (MNG-127) tenyésztését és az adagolt szubsztrátum mikrobiológiai átalakítását az 1. példában leírt körülmények között végezzük. A kinőtt tenyészethez szubsztrátumként 100 ml-enként 20 mg a-acetil-digitoxint adagolunk 1 ml etanolban oldva. 4 napig tartó fermentáció után a termék kivonását és a kromatografálást az 1. példában leírt körülmények között végezzük, azzal az eltéréssel, hogy az oldószer-gradienst úgy állítjuk be, hogy a kiindulási 35 : 55 : 2,5 ciklohexán : etilacetát : abszolút etanol összetételű oldószerkeverék 1600 ml-nél 35 : 55 : 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 SS 60 65 3
