175306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új polipeptidek előállítására
29 175306 30 (acetát formájú) készült oszlopon átbocsátjuk és Uofilizáljuk, A kapott terméket ezután 20 ml vízben feloldjuk, majd a vizes oldatot felvisszük egy 2,6 cm-szer 25 cm méretű, karboximetil-cellulózból készült oszlopra. Az oszlopot ezután 800 ml 0,005 mólos és 800 ml 0,2 mólos vizes ammónium-acetát-oldattal gradiens-eluálásnak vetjük alá. Az 1200 ml és 1530 ml közötti frakciókat összeöntjük, majd Uofilizáljuk. így 167 mg mennyiségben fehér pelyhes csapadék alakjában a cím szerinti vegyületet kapjuk, amelynek fajlagos forgatóképessége [a]*3 = -28,93° (c = 0,6, vízben). Elemzési eredmények a C44H61 OsNi j ’2C2H402 '3,5H2 O képlet alapján: számított: C =54,64%, H =7,26%, N = 14,60%, talált: C =54,64%, H =7,58%, N = 14,37%. Aminosav-elemzés : Arg: 1,06, Gly: 1,00, Leu: 1,11, Tyr: 0,87, Phe: 2,09, /3—Ala: 1,14 (peptidtartalom 82,0%). 14. példa H—ß—Ala—Arg—Ser—Phe—Phe—Tyr—Gly—NH2 előállítása a) Z-d—Alá—Arg(Tos)—Ser(Bzl)-Phe—Phe— —Tyr(Bzl)—Gly-gyanta előállítása Szilárd fázisú peptidszintetizátor (Simadzu APS—800) reaktorterébe bemérünk 4,02 g BOC—Gly-gyantát (2,17 millimól Gly-t tartalmaz), majd a reaktortérbe Merrifield módszere szerint egymást követően BOC-Tyr(Bzl)-OH-t, BOC-Phe-OH-t, BOC-Phe-OH-t, BOC —Ser(Bzl)—OH-t, Aoc—Arg(Tos)—OH-t és Z—ß—Ala—OH-t táplálunk be. Miután minden reakció befejeződött, a gyantát diklór-metánnal, metanollal, dimetil-formamiddal, jégecettel és metanollal mossuk, végül pedig szárítjuk. így a cím szerinti gyantából 6,4 g-ot kapunk. b) Z-P-Ala—Arg(Tos)—Ser(Bzl)-Phe -Phe - -Tyr(Bzl)-Gly-NH2 előállítása 50 ml 17%-os metanolos ammónia-oldatban az a) lépésben előállított gyantából 5,9 g-ot szuszpendálunk, majd a kapott szuszpenziót szobahőmérsékleten 48 órán át keverjük. A gyantát ezután kiszűijük, majd dimetil-formamiddal mossuk. A mosófolyadékot a szűrlettel összeöntjük, majd a kapott elegy et csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz dietilétert adunk, majd a képződött port kiszűrjük. így a cím szerinti vegyületből 2,02 g-ot kapunk. c) H-0—Ala—Arg—Ser—Phe—Phe—Tyr—Gly—NH2 előállítása 10 10 nü vízmentes hidrogén-fluoridban feloldunk a b) lépésben kapott nyers védett peptidamidból 1,0 g-ot, majd a kapott oldathoz 1 ml anizolt adunk és 0 C-on 60 percen át keverjük. Ezután csökkentett nyomáson a hidrogén-fluoridot ledesztilláljuk, majd a maradékot 20 ml vízben feloldjuk. A vizes oldatot kétszer 10 ml dietiléterrel mossuk, ezután 1,0 cm-szer 15 cm méretű, Amberlite IRA-410 márkanevű gyantából készült oszlopon átbocsátjuk és liofilizáljuk. A terméket 10 ml vízben feloldjuk, majd a vizes oldatot felvisszük egy 2,5 cm-szer 25 cm méretű, karboximetil-cellulózból készült oszlopra. Az oszlopot 800 ml 0,005 mólos és 800 ml 0,2 mólos vizes ammónium-acetát-oldattal gradiens-eluálásnak vetjük alá. A 800 ml és 950 ml közötti frakciókat összeöntjük, majd liofilizáljuk. A terméket ezután eluálószerként vizet használva mégegyszer átbocsátjuk egy 2 cm-szer 10 cm méretű, Amberlite XAD—2 márkanevű gyantából (a Rohm & Haas Co. Ltd. amerikai egyesült államokbeli cég által előállított polisztirolgyanta) készült oszlopon, majd az eluátumot liofilizáljuk. így 55 mg mennyiségben fehér pelyhes csapadék formájában a cím szerinti vegyületet kapjuk, amelynek fajlagos forgatóképessége [a]p4 - —30,11° (c = 0,47, vízben). Aminosav-elemzés : Arg: 1,04, Ser: 0,96, Gly: 1,00, Tyr: 0,88, Phe: 2,10, 0-Ala: 0,98 (peptidtartalom 83,0%). 15. példa H-0-Ala-Arg-Pro-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro—Lys—Alá—OH előállítása 30 ml metanolban feloldunk 1,16 g Z-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys(BOC)-Ala-OtBu-t, majd a kapott oldaton katalizátorként palládiumkormot használva 4 órán át hidrogéngázt vezetünk keresztül. A katalizátort ezután kiszűrjük, majd a szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot feloldjuk 15 ml dimetil-formamidban, majd az így kapott oldathoz 492 mg Z-0-Ala-Arg(NO2 )-Pro-OH-t és 200 mg HONB-t, ezután pedig hűtés közben 250 mg DCC-t adunk. A reakcióelegyet ezt követően 18 órán át keverjük. Ezután az oldhatatlan részt kiszűrjük, majd a szűrletből a dimetil-formamidot csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékhoz etil-acetátot adunk, majd a képződött port kiszűrése után szárítjuk és 10 ml trifluorecetsavban feloldjuk. A kapott oldatot 40 percen át állni hagyjuk, majd a trifluorecetsavat csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és a maradékot 30 ml jégecetben feloldjuk. A kapott oldaton katalizátorként palládiumkormot használva 16 órán át hidrogéngázt vezetünk keresztül. Ezután a katalizátort kiszűrjük, majd a szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és az így kapott maradékot 10 ml vízben feloldjuk. Amberlite IRA-410 gyantával végzett ioncsere után a kis mennyiségű oldhatatlan részt kiszűrjük, majd a szűrletet felvisszük egy 2,2 cm-szer 30 cm méretű, karboximetil-cellulózból készült oszlopra. Az oszlopot 800 ml 0,005 mólos és 800 ml 0,2 mólos vizes ammónium-acetát-oldattal gradiens-eluálásnak vetjük alá. A 820 ml és 1180 ml közötti 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
