175295. lajstromszámú szabadalom • Elkárás enzimek, enzim inhibotorok és antitestek immobilizálására vagy stabilizálására
5 175295 6 elkészített 10 ml 0,1 M vizes 1,4-benzokinon oldattal kezelünk. Az elegyet egy éjjelen át fénytől elzárt lombikban keverjük. Az aktivált anyagot ezután egy oszlopra (0,9 x 15 cm) öntjük és 200 ml 0,05 M nátrium-foszfát pufferrel (pH = 7,4) mossuk, majd enzimmel reagáltatjuk, és az 1. példa eljárásával analóg módon mossuk. Ezzel az eljárással olyan szilárd terméket kapunk, mely milliliterenként 65 egység észterázaktivitást mutat. 4. példa Tripszin immobilizálása p-amino-benzil-cellulózon 1,4-benzokinonnal 2 g p-amino-benzil-cellulózt (0,11 milliekvivalens per gramm) (British Drug-Houses Ltd. Laboratory Chemicals Division) vízben szuszpendálunk, az elegyet egy oszlopra (0,9x15 cm) öntjük, és három mosási ciklusban, egyenként 50 ml 0,1 N vizes sósavoldattal, 20 ml vízzel, 50 ml 0,1 N vizes nátrium-hidroxid-oldattal és 20 ml vízzel mossuk. Az anyagot ezután 200 ml 0,05 M nátrium-foszfát pufferrel 7,4 pH-án mossuk és két egyenlő részre osztjuk. Az egyik részt 25 ml előbbi pufferben elszuszpendáljuk, 4 ml frissen elkészített 0,1 M vizes 1,4-benzokinon oldattal reagáltatjuk, és az elegyet két napig szobahőmérsékleten keverjük. Az így kapott barna színű szilárd anyagot egy oszlopon (0,9x15 cm) 150 ml előbbi pufferrel mossuk. Az anyagot ezután 25 ml előbbi pufferben elszuszpendáljuk, lehűtjük, majd a szuszpenzióhoz 5 ml hideg, vizes tripszinoldatot (10mg/ml) adunk. Az elegyet két napig 4 °C hőmérsékleten keverjük, majd az anyagot egy oszlopra (0,9 x 15 cm) öntve, a reakcióhoz használt pufferrel addig mossuk, míg a mosófolyadék spektrofotometriásán mérve (280 nm-nél) fehérjét már nem tartalmaz. Az így előállított termék grammonként 55 egység tripszin-észteráz-aktivitást mutat. 5. példa Penicillin-aciláz immobilizálása 4B szefarózon 1,4-benzokinonnal 4 ml 4B szefaróz mintáját az 1. példában leírt módon, és utána 100 ml 0,05 M nátrium-foszfát pufferben 8,0 pH-án mossuk, majd 16 ml azonos pufferoldatban elszuszpendáljuk és 5 ml frissen elkészített 0,1 m vizes 1,4-benzokinon oldattal reagáltatjuk. Az elegyet fénytől elzárt lombikban szobahőmérsékleten, 13 óra hosszat keverjük. Az így kapott sötét anyagot egy oszlopon (0,9x15 cm) 100 ml előbbi pufferrel mossuk, majd 6 ml pufferoldatban elszuszpendáljuk, és azonos pufferben Escherichia coli ATCC 9637-ből kapott 25 ml penicillin-aciláz oldatot adunk hozzá [az enzim Marconi és munkatársai: Journal of Antibiotics 26, 228/1973 szerint állítható elő]. Az elegyet szobahőmérsékleten keverjük, majd egy oszlopra (0,9 x 15 cm) öntjük, és az anyagot váltakozó frakciókban 15 ml 0,05 M és 15 ml 1 M foszfát pufferrel (pH = 8,0) mossuk. Az összes mosófolyadék 150 ml, amelyből spektrofotometriásán 280 nm-nél mérve, csak az első 50 ml tartalmaz fehérjét. Az így kapott, enzimtartalmú sötét anyag milliliterenként 125 egység enzimaktivitást mutat. A szilárd anyaggal reagáltatott, 1400 enzimegységet tartalmazó 25 ml enzimoldat fajlagos aktivitása 21,1 egység/mg, míg az egyesített reakcióelegy anyalúgja és a szilárd anyag mosófolyadékai 905 enzimegységet tartalmaznak. Gyakorlatilag a reagáltatott enzim egész mennyiségét kinyerjük, ezenkívül az immobilizált enzim azonos aktivitást mutat mint ami az oldatban volt. A kinonnal nem kezelt, de az előzőekben leírt eljárás szerint enzimmel kezelt 4B szefaróz mintája enzimaktivitást nem mutat, ami azt bizonyítja, hogy ilyen körülmények között a hordozóanyagon enzimadszorpció nem megy végbe. [Az enzimaktivitást 37 °C hőmérsékleten penicillin G, mint szubsztrátum, alkalmazásával 8,0 pH-án, Marconi és munkatársai: Journal of Antibiotics, 26, 228 (1973) szerint határozzuk meg]. Egy enzimegység az enzim olyan mennyisége, mely a tesztkörülmények között percenként egy mikrontól penicillin G-t hidrolizál. Az immobilizált enzim egy hónapon át történő ismételt felhasználása csak jelentéktelen aktivitásveszteséget mutat. 6. példa Penicillin-aciláz immobilizálása 4B szefarózon 1,4-benzokinonnal Az előző példa eljárásával analóg módon 4 ml 4B szefaróz mintát mossuk és 1,4-benzokinonnal aktiváljuk. Az anyagot ezután 2,7 egység/mg fajlagos aktivitású Escherichia coliból kapott 1580 egység penicillin-acilázzal reagáltatjuk. A reakcióidő 15 óra, míg az eljárás további része és a mosás azonos az előző példa módszerével. A reakcióelegy anyalúgjában és a mosóvizekben 1300 egység enzimaktivitás található, míg a szilárd anyag 67,5 egység/ml enzimaktivitást mutat. Megjegyezzük, hogy az eljárás egyaránt megfelelő eredményt ad abban az esetben is, ha nem teljesen tiszta enzimet alkalmazunk. Ezen túlmenően, ebben az esetben az immobilizált enzim egy hónapon át történő többszöri felhasználása csak jelentéktelen aktivitásveszteséget mutat. 7. példa Penicillin-aciláz immobilizálása 4B-AH szefarózon 1,2-naftokinonnal 1 g 4B—AH szefarózt az 1. példa eljárása szerint kezelünk, és 0,5 M vizes sósavoldattal mosunk. Az anyagot ezután 100 ml 0,05 M nátrium-foszfát puf-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
