175295. lajstromszámú szabadalom • Elkárás enzimek, enzim inhibotorok és antitestek immobilizálására vagy stabilizálására
7 175295 8 ferrel 8,0 pH-ig mossuk, majd 25 ml ilyen pufferoldatban elszuszpendáljuk és 25 ml dioxánban oldott 0,5 mmól 1,2-naftokinont adunk hozzá. Az elegyet fénytől elzárt lombikban szobahőmérsékleten 18 óra hosszat keverjük, majd szűrjük, és a szilárd anyagót 50 ml 1:1 térfogatarányú 0,05 M foszfátpuffer és dioxán oldatával mossuk. A szilárd anyagot ezután egy oszlopra (0,9 x 15 cm) öntjük, és 100 ml pufferoldattal mossuk. Az így kapott fekete terméket penicillin-acilázzal (Escherichia coli ATCC 9637-ből) reagáltatjuk. A 4 ml aktivált 4B—AH szefarózt és 2030 enzimegységet tartalmazó reakcióelegy fajlagos aktivitása 2,7 egység/mg 30 ml 0,05 M foszfátpufferben 8,0 pH-án. az elegyet 1 óra hosszat szobahőmérsékleten, és 48 óra hosszat 4 °C hőmérsékleten keverjük, majd a szilárd anyagot az 5. példában leírt módon mossuk. Ezen művelet után a kapott enzim a hordozóanyag milliliteréként 55 egységaktivitást mutat, míg az anyalúgból és a mosófolyadékokból kimutatott enzim összesen 1815 egység. Ezenkívül, ebben az esetben enzimveszteség nincs és az immobilizált enzim azonos aktivitást mutat, mint ami az oldatban volt. 8. példa Peroxidáz immobilizálása 4B szefarózon 1,4-benzokinonnal Az 5. példában megadott eljárás szerint 4 ml 4 B szefarózt 0,5 mmól 1,4-benzokinonnal 8,0 pH-án aktiválunk, majd az anyagot peroxidázzal kezeljük (Boehringer Mannheim GmbH, 6800 Mannheim 31, Német Szövetségi Köztársaság, cég I. minőségű terméke). Az összesen 30 ml reakcióelegy 4 ml aktivált 4B szefarózt, 100 mg enzimet és 0,05 M foszfátpuffert (pH = 6,0) tartalmaz. A reakcióelegyet 4 °C hőmérsékleten 24 óra hosszat keverjük, majd az anyagot váltakozva részletenként 15 ml 0,05 M és 0,5 M foszfátpufferrel (pH = 6,0), összesen 150 ml oldattal mossuk. A tesztelt anyag végső aktivitása 488 egység/ml hordozóanyag. A peroxidáz-aktivitást ABTS-el [2,2’-azino-di(3- etil-benztiazolin)-6’-szulfonsav, Boehringer Mannheim GmbH] és hidrogén-peroxiddal 25 °C hőmérsék létén és 7,0 pH-án, a cég által megadott módszer szerint határozzuk meg. Egy enzimegység az enzim azon mennyisége, mely percenként 1 mikronról reagenst átalakít. 9. példa Anti—T3 antitest immobilizálása 1,4-benzokinonnal 4B szefarózon Az 5. példában megadott eljárás szerint 4 ml 4B szefarózt 0,5 mmól 1,4-benzokinonnal aktiválunk, majd tengerimalacból vett anti-T3 antiszérummal (3,3’,5-trijód-tironin) reagáltatjuk. A reakcióelegy 4 ml aktivált 4B szefarózt, 20 ml antiszérumot, 0,2 M kálium-foszfát puffert, 0,1 M kálium-kloridot (pH = 7,4) tartalmaz 30 ml össztérfogatban. A reakcióelegyet enyhe keverés közben egy éjjelen át 4 °C hőmérsékleten tartjuk, ezután a szilárd anyagot leszűrjük és 200 ml 0,02 M kálium-foszfát pufferrel és 0,05 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid (Tris—HCl) pufferrel 7,4 pH-án mossuk, majd ugyanebben a pufferben 4 °C hőmérsékleten 24 óra hosszat tartjuk. Párhuzamosan ugyanezt a műveletet végezzük el vakpróbán, melyet csak antiszérummal kezelünk. Az így elkészített két szilárd hordozóanyagon a T3 hormon kivonására elvégzett teszt a következő: 0,6 ml hordozóanyagot (mintegy 20 mg szárazanyaggal egyenlő) 35 nanogrammú J125 atommal jelzett T3 hormonnal összesen 1,5 ml-re beállítunk, mely 0,2 M foszfátpuffert és 0,1 M kálium-kloridot tartalmaz 7,4 pH-án, majd 1 óra hosszat 37 °C hőmérsékleten, és egy éjjelen át 4 °C hőmérsékleten tartjuk. A folyadékot a szilárd anyagtól elválasztjuk és a szilárd anyag radioaktivitását mérjük. Az antiszérummal kezelt szilárd anyag az összes radioaktivitás 58%-át, míg a vakpróba csak a 11%-át veszi fel. 10. példa Szójababból kapott tripszin inhibitor immobilizálása 4B szefarózon 1,4-benzokinonnal Az 5. példa eljárása szerint 4 ml 4B szefarózt mosunk, és 0,5 mmól 1,4-benzokinonnal aktiválunk, majd szójababból kapott 60 mg tripszin inhibitort (Boehringer Mannheim GmbH) tartalmazó 25 ml 0,02 M nátrium-foszfát pufferrel 8,0 pH-án 10 óra hosszat reagáltatjuk. Az anyagot ezután 0,1 M kálium-klorid pufferrel és 0,02 M nátrium-foszfáttal 8,0 pH-án addig mossuk, míg a mosófolyadék fehérjét már nem tartalmaz. Az anyalúgot és a mosó folyadékot egyesítve analizáljuk, mely 46 mg maradék fehérjét tartalmaz. A hordozóanyagot ezután 200 ml 0,05 M .Trisz-hidrokloridot, 0,1 M kálium-kloridot és 0,02 M kalcium-kloridot tartalmazó pufferben 8,0 pH-án mossuk, majd ugyanebben a pufferben 4 °C hőmérsékleten 24 óra hosszat állni hagyjuk. Az így előállított 4 ml készítmény a nem immobilizált inhibitoron felül 63% hatásfokkal 13,2 mg kristályos tripszint képes megkötni [meghatározása L. J. Loeffler és I. V. Pierce: Biochimica et Biophysica Acta 317. 20 (1973) szerint]. 11. példa Tripszin stabilizálása 1,4-benzokinonnal 50 mg kristályos tripszint (British Drug Houses) 50 ml 0,05 M nátrium-foszfát pufferben 7,3 pH-án oldunk és 0,2 ml 0,1 M vizes 1,4-benzokinon-oldatot adunk hozzá. Az elegyet 2 óra hosszat szobahőmérsékleten, majd 20 óra hosszat 4 °C hőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet ezután hígított 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
