175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
49 175266 50 A pH-t nátrium-hidroxiddal 7,2—7,4-re igazítjuk. Beoltás után a lombikokat 28 °C±1 °C-on inkubáljuk és 220 percenkénti fordulatszámú pörgő rázóberendezésen rázzuk 3 napig. A lombikokat 5 Vibrio percolans ATCC 8461 próbatenyészet sztandard alkalmazásával elemezzük, l,27cm-es lemezeket a centrifugált fermentlé mintákba mártjuk. A mintákat 0,05 M foszfát-pufferrel hígítjuk, pH = 7,4. Az eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza: 10 kor (óra) PH Vibrio percolans (1/100 hígítású kísérlet) 890 kísérlet egység/ml 72 6,4 23 mm 15 103. A 890 A/egység/ml meghatározása a 890 Ai és 890 A3 antibiotikumok meghatározási módszereinek II részében található. 20 Az egész lét 200ml-es adagokban polikarbonát palackokban 9000 percenkénti fordulatszámmal 15 percig centrifugáljuk és így 1600 ml 104 egység/ml hatást mutató felülúszót kapunk. 0,5 ml semleges EDTA-t adunk hozzá. 25 A centrifugált lét Dowex— 1 x 2 klorid ciklusú 50—100 mesh gyantával töltött oszlopra adszorbeáljuk, az ágy méretei 3,8 x 22 cm, 6-20 ml/min áramlási sebességgel. Az oszlopot 100 ml ionmentes vízzel öblítjük és 1 liter 50 g nátrium-kloridot, 0,02 30 M trisz-hidroklorid puffért és 25 pM semleges EDTA-t tartalmazó ionmentes vízzel eluáljuk 6 ml/min áramlási sebességgel. 10 ml-es frakciókat kapunk. A 890 Ai antibiotikum a 13—81. frakciókban 35 jelenik meg, a maximum a 25—33. frakcióknál tűnik fel a sóeluátum első felvitelétől számítva. A 24—41. frakciókat, melyek legnagyobb biohatás/A220 arányt mutatják, további feldolgozásra összeöntjük. Az összeöntött frakciók összesen 40 29 000 egységet vagy a felvitt biöaktivitás 17%-át tartalmazzák. ’ A Dowex eluátumot 10 ml-re koncentráljuk és a pH-t híg sósav hozzáadásával 6,5-re igazítjuk, és a koncentrácumot XAD—2-oszlopra visszük, melynek 45 ágy dimenziói 3,3 x 36 cm és melyet előzőleg 2 liter 60%-os vizes acetonnal ionmentes vízzel, és 5% súly/térfogat százalékos nátrium-kloridot tartalmazó ionmentes vízzel mostunk. A mintát ionmentes vízzel 6 ml/min sebességgel eluáljuk. 40—260 ml-es 50 frakciókat kapunk. Az antibiotikum aktivitás a 6—14. frakciókban jelenik meg, az eluált térfogat 220-2560 ml-ig terjed. A csúcs a 9— 10-es frakcióknál 370—590 ml-nél jelenik meg. A 9-12-es frakciók, melyek 55 370-1060 ml eluált térfogatig terjednek, mutatják a legmagasabb HAEA30o/A22o arányt és további feldolgozásra összeöntjük a fenti frakciókat. Ezek a frakciók 36 000 egységet tartalmaznak, ez a felvitt aktivitás 126%-ának felel meg. A 9-12-es egye- 60 sített frakciókat 100 ml-re sűrítjük be és a koncentrátumot Dowex 1x4 klorid ciklusú-400 mesh, 2,2 x 41 cm ágy-méretű oszlopra visszük 2 ml/min áramlási sebességgel. Az oszlopot 50 ml ionmentes vízzel öblítjük és 3 liter 0,07 M 65 nátrium-kloridot + 0,005 M ammónium-kloridot és 0,0001M ammóniát tartalmazó ionmentes vízzel öblítjük 2 ml/min sebességgel. 10,8 ml-es frakciókat gyűjtünk össze az első eluáló alkalmazásától kezdve. A 890 A! antibiotikum főcsúcsa a 181-217-es frakciókban jelenik meg a maximum a 198-as frakciónál jelentkezik. A 186-210 frakciókat, melyek összesen 114 abszorpciós egységet tartalmaznak 300 nm-nél, összeöntjük. Az egyesített frakciókat 4,0 ml-re koncentráljuk és a pH-t 7,3-re állítjuk be 16 pl 1 M nátrium-hidroxid hozzáadásával. A koncentrátumot 2,15x70 cm ágyméretű Bio—Gel P-2, 20—400. mesh oszlopra visszük és 3 x 1 ml ionmentes vízzel mossuk és 0,96 ml/min sebességgel ionmentes vízzel eluáljuk. 3,85 ml-es frakciókat öntünk össze. A 890 A! főcsúcsa a 24—44-es frakciókban és a maximum a 33. és 34. frakciókban jelenik meg. A 27-38. frakciókat egyesítjük Uofüizálás céljából. A fenti frakcióknak a legmagasabb az A300/A24S aránya. Az egyesített frakciók 72A30o egységet tartalmaznak. A liofiiizálás elvégzése végett az összeöntött frakciókat 3,0 ml-re koncentráljuk és a koncéntrátum pH-ját 10 pl 0,1 M nátrium-hidroxid hozzáadásával 7,5-re állítjuk be. A mintát két 1,50 ml-es részre osztjuk és a részeket gyorsan megfagyasztjuk és 14 ml-es üveg, csavaros kupakkal ellátott kémcsövekből liofílizáljuk. Az egyes minták 1,73 mg 890 A!, azaz 35,8 A300 egységet tartalmaznak. A fenti anyag 3. példa szerinti dezacetilezésével dezacetil 890 Aj antibiotikumot kapunk. A dezacetil 890 At és dezacetil 890 A3 antibiotikumokat tartalmazó és a tienamicint tartalmazó gyógyszerkészítményeket többféle egység dózisformában adagolhatjuk, például szilárd vagy folyékony orálisan fagyasztható dózis formában. A készítmény/egységdózis, akár folyékony, akár szilárd 0,1—99% hatóanyagot tartalmazhat, előnyösen 10—60% körüli mennyiséget tartalmaz. A készítmények általában 25-1000 mg körüli mennyiségben tartalmaznak hatóanyagot a készítmény összsúlyára vonatkoztatva, azonban előnyösen 250 mg-1000 mg-ig terjedő dózis mennyiségeket alkalmazunk. A parenterális adagolásnál az egységdózis rendszerint tiszta anyag enyhén megsavanyított steril vizes oldatban vagy oldat készítésre alkalmas oldható por formájában. A következő módon állíthatunk elő például készítményt: Kapszula Kapszulánként dezacetil 890 A, 400 mg laktóz, U. S. P. 0-ás egyenként 475 mg-ot tartalmazó kapszulák megtöltésére elegendő mennyiség A fenti példában a hatóanyagot és a hígítószert összekeverjük, homogén elegyet kapunk, melyet ezután 0-ás kemény zselatin kapszulákba öntünk kézzel vagy gépi erővel szükség szerint. A keverést előnyösen 40%-nál kisebb relatív nedvességtartalmú helyiségben végezzük. 25
