175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
47 175266 48 40—43. frakciókat összeöntjük, 260A30o egységet tartalmaznak, melyek közül 173 hidroxilaminnal kioltható. A 890 A3 antibiotikum 890 A, antibiotikummal való szennyezettségének megszüntetésére az egyesített sómentesített 40-43-as frakciókat 50 p liter penicillinázzal [Difco „Bacto-Penase” 500 000 egységet tartalmaz milliliterenként (1000 LU/ml — ahol LU Levy egységet jelent, 1000 LU 500 000 penicillin G-t inaktivál)] és 0,1 ml 1M trisz-hidroklorid pufferrel, pH = 7,5 kezeljük. A reakcióelegyet 6 óráig hagyjuk állni 23 °C-on majd 3 ml ionmentes vizet és 15 ml metanolt adunk hozzá. Ezt az elegyet 2,15x44cm ágy-dimenziójú Dowex 1x2 klorid ciklusban levő minus 400 mesh 50%-os metanolba helyezett és két liter 50 térfogatszázalékos metanollal mosott gyantával töltött oszlopra visszük. A 890 A3 antibiotikumot 2 liter 0,05M nátrium-kloridot és 0,005M ammónium-kloridot és 0,0001 M ammóniát tartalmazó 50%-os metanollal eluáljuk. 9,2 ml-es frakciókat kapunk. A 300 nm-nél méri ultraibolya abszorpció fő csúcsa a 74—88. frakciókban jelenik meg. A 78—85-ös frakciókat egyesítjük. A metanolt csökkentett nyomáson bepárlással eltávolítjuk és az ezekben a frakciókban kapott összes abszorpciós egységek száma 300 nm-nél 97,6, melyekből 87,5 hidroxilaminnal reagálva kioltható. A 70—85. összeöntött frakciókat 3,92ml-re koncentráljuk csökkentett nyomáson rotációs bepárlással és a koncentrátumot 2,15x70 cm ágy-dimenziójú 4ml 4M ammóniával mosott, majd 0,15 mM ammóniát tartalmazó ionmentes vízzel egyensúlyba hozott Sephadex G—10 oszlopra visszük. Kétszer mossuk 1 ml 0,02 mM ammóniával és a 890 A3 antibiotikumot 0,02 mM ammóniával eluáljuk 0,8ml/min áramlási sebességgel. Negyvenkilenc 2,45 ml-es frakciót, majd húsz 3,3 ml-es frakciót gyűjtünk össze. A fő abszorpciós csúcs 300 nm-nél a 35—53. frakciókban jelenik meg. A legnagyobb A3000IAA2s értékű 38-46. frakciókat további feldolgozásra összeöntjük. Az egyesített frakció 300 nm-nél 65 abszorpciós egységet tartalmaz. Az egyesített frakciókat rotációs bepárlón csökkentett nyomáson 2,84 ml-re besűrítjük és egyenlő részekre osztjuk, gyorsan megfagyasztjuk és egyenként 14 ml-es 1,772 g-os üveg ampullákban liofilizáljuk, hogy így 890 A3 antibiotikumot kapjunk. Egy minta 0,88 mg-ban 32A300 egységet és a másik minta 0,82 mg-ban 31,9 A30o egységet tartalmaz. Az előző 32,0 A300 egységet tartalmazó mintát NMR analízisnek vetjük alá és a következő csúcsokat kapjuk: 1,29 (dublett, J = 6,5), 1,98 (szingulett), 3;42 (dublett J = 5 dublett J = 2,4),~4,01 —4,28 (multiplen), 3,14 (dublett, J = 5, dublett J = 9), 3,39 (triple« J = 6,5), 2,92 (dublett J = ~4 és triple« J = 6). A fenti táblázat felsorolja a D2 O-ban kapott 100 MHz—NMR jeleket a 890 A3 nátrium-sóra 2,2-dimetü-2-szilapentán-5-szulfonát nátriumsó belső sztandardhoz viszonyítva, és a kémiai kötések okozta sáveltolódásokat ppm-ben és a konstansokat Hz-ben adjuk meg és a látható multiplicitásokat feltüntetjük. A kapott anyag 4. példa szerint végzett dezacetilezésével dezacetil 890 A3 antibiotikumot kapunk. 11. példa 890 A] antibiotikum előállítása Streptomyces flavogriseus MA—4600a liofilizált tenyészetet tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitunk és a tartalmát 1,5 ml steril A táptalaját tartalmazó kémcsőben szuszpendáljuk. A táptalaj összetétele a következő: élesztő extraktum 10,0 g glükóz 10,0 g magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g foszfát-puffer 2 ml desztillált víz 1000 ml Foszfát puffer oldat kálium-dihidrogénszulfát 91,0 g dinátrium-hidrogénfoszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml Ezzel a szuszpenzióval beoltunk egy 54 ml B táptalajt tartalmazó 250 ml-es háromszoros dugóval ellátó« Erlenmeyer lombikot, tétele a következő: A B táptalaj összeB táptalaj autolizált élesztő (Ardamin*) lő,0 g glükóz 10,0 g magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g foszfát-puffer 2 ml desztillált víz 1000 ml a pH-t nátrium-hidroxid hozzáadásával 6,5-re módosítjuk. Ardamin*: Yeats Products Corporation Foszfát puffer oldat kálium-dihidrogénfoszfát 91,0 g dinátrium-hidrogénfoszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml. Az oltott tenyészetet tartalmazó lombikot vattával bedugaszoljuk és 30 óráig rázatjuk 28 °C-on ± 1 °C-on 220 percenkénti fordulatszámú pörgő rázóberendezésen (5,08 cm-es löket) ötven 250 ml-es nem-bedugaszolt 40 ml C táptalajt tartalmazó Erlenmeyer lombikot beoltunk 1 ml/lombik beoltott tenyészetet tartalmazó lével. A lombikokat vattával bedugaszoljuk. C táptalaj paradicsompép 20,0 g primér élesztő 10,0 g dextrin (Amidex) 20,0 g kobalt-kloríd-hexahidrát 5,0 mg desztiMt vív 1000 ml. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 24
