175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
45 175266 46 tartalmazó 756 literes rozsdamentes acélfermentort beoltsunk vele, ahol a C táptalaj összetétele a következő: C táptalaj paradicsompép 20,0 g primér élesztő 10,0 g dextrin (Amidex) 20,0 g kobaltklorid-hexahidrát 5,0 mg desztillált víz 1000 ml. a pH-t nátrium-hidroxid alkalmazásával 7,2-7,4-re állítjuk. Ezt a fermentort 25 °C on 146 percenkénti fordulatszámú keverési sebességgel 92 óráig 4,23 li- 5 ter/sec légáramlási sebességgel működtetjük. Szükség esetén adunk még hozzá 0,1%-ot meg nem haladó mennyiségű Polyglycol 2000 habzásgátlót. Antibaktériális kísérleteket végzünk Salmonella gallinarum MB1287, Vibrio percolans ATCC 8461 j0 törzsekkel és a következő eredményeket kapjuk: Kor (óra) 0 12 24 36 48 ó0 72 84 92 pH 6,6 6.7 6,65 6,3 6,0 6,4 6,15 6,5 6,5 MB—1287 mmS-19 26 28 32 ATCC 8461 mm(l—10)S-21 24 26 30 890 A egység/ml NA NA 6,8 13,5 24,9 24,3 A 890 A egység/ml meghatározása a 890 A! és 890 A3 antibiotikumok elemzési módszereinek II. szakaszában található. 56,25 liter fermentlét 5 °C-ra hütünk és Titan P—9 centrifugán centrifugálunk. 22,5 kg Celitet adunk hozzá a 45 liter felülűszóhoz és a szuszpenziót Shriver 45,3 cm-es szűrőprésen szűrjük. 38.9 liter szűrletet 31,5 Dowex—1 x 2 klorid ciklusú 30 50—100 mesh gyantát tartalmazó oszlopon adszorbeáltatjuk és az oszlopot 4,5 liter ionmentes vízzel mossuk. A 890 At és a 890 A3 antibiotikumok elegyét 14,5 liter 5%-os nátrium-kloridot és 0,01 M trisz-hidroklorid puffert (pH = 7) + 0,25/rM semleges 35 EDTA-t tartalmazó ionmentes víz eleggyel eluáljuk. 2,25 literes frakciókat fogunk fel. A 890 Aj és a 890 A3 antibiotikumok elegye a 3—6-os frakciókban jelenik meg és a maximális hatásosságot a 4-5-ös frakciók mutatják. A 4,5 és 6-os frakciót a 40 szűrt lé aktivitásának 8%-t tartalmazzák, ezeket a frakciókat összeöntjük és csökkentett nyomáson 0,9 literre koncentráljuk. A 0,9 liter koncentrátumot felvisszük 4,5 liter előzetesen 22,5 liter 60%-os vizes acetonnal, majd 45 22,5 liter ionmentes vízzel és 22,5 liter 5%-os nátriumklorid-oldattal mosott XAD—2 oszlopra. A koncentrátumot 15,8 liter ionmentes vízzel eluáljuk. Három 1,12 literes frakciót majd hat 2,25 literes frakciót fogunk fel. Az aktivitás az 1—6. 50 frakciókban, és a csúcsaktivitás a 3-as frakcióban jelenik meg. A XAD oszlopra felvitt össz-aktivitás 64%-át tartalmazó 4 és 5-ös frakciókat vagy 370 000 egységet egyesítünk. A 4 és 5-ös frakciókat 120 ml-re koncentráljuk 55 csökkentett nyomáson végzett bepárlással. A pH-t 6,5-re állítjuk és a koncentrátumot 7 x 50 cm-es XAD—2 oszlopra visszük, mely oszlopot előzőleg 8 liter 60%-os vizes acetonnal, majd 4 liter ionmentes vízzel és 8 liter 5%-os nátriumkloriddal ionmen- 60 tes vízben mostunk. A mintát az ágy szintjéig leengedjük és az oszlopot háromszor 20 ml-es ionmentes víz adaggal öblítjük és minden esetben az ágy szintig leengedjük. Az antibiotikumot ezután 7 liter ionmentes 65 vízzel eluáljuk 40 liter/nún áramlási sebességgel. Nyolc 200 ml-es frakciót, majd tizennégy 400 ml-es 25 frakciót fogunk fel. Az antibiotikum aktivitás a 4—19-es frakciókban jelenik meg, ez az össz-aktivitás 77%-a (a Salmonella gallinarum MB 1287 kísérletnél mértük) és a 6—8 frakciók tartalmazzák a legmagasabb aktivitást. Meghatározzuk a Vibrio percolans ATCC 8461-nál mért bioaktivitás arányát és a frakciók HKAK30o értékét. A 250 értéket mutató frakciók 890 Ai jelenlétére utalnak és ahol ez az érték 31, ott 890 A3 antibiotikum jelenlétére lehet következtetni. A többnyire 890 A3 antibiotikumot tartalmazó 10, 11, 12 és 13-as frakciókat összeöntjük további feldolgozás céljából. A második XAD-2 oszlopról kapott 10—13 egyesített frakciókat 40 ml-re koncentráljuk és egy 2,15x40 cm-es ágyméretű Dowex—1x4 klorid ciklusú levő minus 400 mesh gyantával töltött oszlopra visszük. Az antibiotikumot három liter 0,075 M ammónium-kloridot és 0,001 M ammóniát tartalmazó ionmentes vízzel eluáljuk 3 ml/min sebességgel. 9 ml-es frakciókat fogunk fel. A Vibrio percolans ATCC 8461 törzzsel vizsgált antibiotikum aktivitás a 165—234-es frakciókban jelenik meg és a csúcsaktivitás a 195-201-es frakciókban jelenik meg. Egyesítjük a 186-213-as frakciókat, melyek összesen 472A30o egységet tartalmaznak, eközül 312 kioltható hidroxilamin hatására. Ezeket az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson rotációsán bepárolva 4,2 ml-re koncentráljuk. A koncentrátumot 2,15x60 cm méretű Bio—Gel P—2 (200—400 mesh)-vel töltött oszlopra visszük fel. A mintát lefolytatjuk az ágy szintjéig, kétszer 1 ml ionmentes vízzel öblítjük, majd ágy szintig ismét leengedjük. Az oszlopot 1 ml/min sebességgel ionmentes vízzel eluáljuk és 2,6 ml-es frakciókat fogunk fel. A 890 A3 antibiotikumot a 38—48-as frakciókban eluáljuk, a csúcs a 41-es frakciónál jelentkezik, ennek meghatározása 300nm-nél hidroxilamin kioltási abszorpciós készség méréssel történik. A 23
