175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
41 175266 42-foszfát pufferral egyensúlyba hoztuk. A XAD-2 gyantát használat előtt a következőképpen mostunk: 1. 5. térfogat 1 n nátrium-hidroxiddal, majd ionmentes vízzel ameddig a kifolyó anyag semleges lesz, 2. 5 térfogat 1 n sósavval, majd ionmentes vízzel, ameddig a kifolyó anyag semleges lesz, 3. majd 5 térfogat metanollal, acetonnal, 0,001 M (etilén-dinitril)-tetraecetsav-tetranátriumsóval, végül desztillált vízzel. Használat előtt valamennyi oldószernél vákuumot alkalmazunk. Miután a mintát felvittük az oszlopra, 2 x 2 ml foszfát-puffért viszünk az oszlopra. Az oszlopot 5 °C-on a puffénál 2 ml/min áramlási sebességgel hívjuk elő. Az eluátum 4 ml-es frakcióit összegyűjtjük. A frakciókat 109—309 ml-ig összegyűjtjük és egyesítjük. Ehhez az egyesített eluátumhoz adjuk a 6-os példában kapott XAD—2 gyantaoszlopon tisztított 11,53 mg antibiotikumot, amely 186 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységű. Az egyesített eluátumot a hozzáadott antibiotikummal együtt vákuumban rotációs bepárlóban 10 °C alatti hőmérsékleten 7 ml térfogatra sűrítjük be. A 720 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó oldatot 1,7 cm átmérőjű 90 ml előzetesen a fentiek szerint mosott XAD-2 gyantával töltött oszlopra visszük fel, az oszlopot használat előtt 5 °C-on desztillált vízzel egyensúlyba hoztuk. A minta után 2 x 2 ml desztillált vizet adunk. Az oszlopot 2 ml/min sebességgel desztillált vízzel hívjuk elő. Az eluátumból 4 ml-es frakciókat fogunk fel. A 109—301. frakciókat egyesítjük, és rotációs bepárlóban 10,3 ml térfogatra koncentráljuk. Az 589 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó oldatot liofilizáljuk és 30.140 egység/mg számított aktivitású 23,6 mg antibiotikumot kapunk. Az így előállított antibiotikum fehér, amorf szálas szilárd anyag. Ha a kapott anyag egy mintáját üveg kapillárisban 3 °C/perc sebességgel melegítjük, az anyag a folyékony fázist kihagyva a következő fokozatokban bomlik fel: 130-140 °C-ig lágyulás következik be, miközben a szilárd anyag térfogatában összehúzódik, ez a kontrakció 170—174°C-ig tart, eközben az anyag megsárgul, összezsugorodik, majd fokozatosan intenzívebb színű lesz, 180-200 °C-ig pirosas-barna színeződést figyeltünk meg, végül az anyag elszenesedik, és 205 °C-nál szilárd anyag — nyomok maradnak. Ennek az anyagnak egy további mintáját spektrofotometriásán analizáljuk, az elemzés során az abszorpciós csúcs 296,5 nm-nél figyelhető meg, E}%m =268,2. Az elemanalízis a következő eredményeket adja: 1. Szobahőmérsékleten vákuumban 4 óra hosszat szárítjuk az anyagot, az ennek következtében fellépő súlyveszteség 5,67%. 2. összetétel: C = 47,68%, H = 6,22%, N= 11,48%. Ezek az eredmények a következő tapasztalati képletnek felelnek meg: CnHu N204S. (NH3)o,28-A tapasztalati képletnek megfelelő számított összetétel: C =47,68%, H =6,13%, N =11,52%, S =11,57% és 0 =23,1%. Ugyanennek a mintának 1 mg/ml töménységű oldatát lOmM kálium-foszfát pufferban polarimetriásan elemezve a fajlagos optikai forgatóképesség [a]2 *D7°C = +80. A nujolos minta infravörös spektruma (1. ábra) a karakterisztikus abszorpciós csúcsokat 1765 cm'1, 1650-1550 cm'1, 2800-2500 cm'1 és 3500—3100 cm"1 értékeknél mutatja. A termék D2 O-ban oldott mintája 100MHz-nél a következő NMR-spektrumot mutatja: S = 1,275-nél dublett, 6 = 3,39-nél egy dublett pár és 0=3,15 és S = 4,20-nál multiple« jelentkezik, ezek a csúcsok jellemzőek a tienamicinra. A kapott tienamicint a 8. példa szerint acetilezhetjük és így N-acetil-tienamicint állítunk elő. 9. példa A tienamicin acetilezése 10,9 mg tienamicint 10 percig kevertetünk 0cC-on Imi száraz dimetilformamid és 2ml frissen készített ecetsavanhidrid elegyében. A dimetilf orma mi dot és az ecetsavanhidridet 5—6 alkalommal ismételt 25—40 ml hexánnal történő mosással és 1 ml száraz dietiléter hozzáadása után még egy utolsó adag hexánnal történő mosással távolítjuk el. Az N-acetiltienamicin nyers mintát 20 ml ionmentes vízzel oldjuk. 100/uniói trisz-bázist(trisz/hidroximetil)aminometánt és 35 /umol sósavat tartalmaz. A minta feloldása után a pH 7,9. Az oldat 298 nm-nél 244 abszorpciós egységet tartalmaz és egy 0,1 ml 1000-szeres hígítású oldatot tartalmazó 1,127 cm-es kísérleti tenyészet 23-as gátlási zónát ad 25 °C-on ATCC 8461 tenyészetek inkubálása hatására. Ezt a mintát 1,3 cm 14 cm ágyméretű Dowex 1x4 klorid ciklusú minus 400 mesh méretű gyantával töltött oszlopra visszük. Az oszlopot 10 ml ionmentes vízzel mossuk és az N-acetil-tienamicint ionmentes vízben oldott 0,07 M nátrium-klorid, 0,005 M ammónium-klorid és 0,0001 M ammóniát tartalmazó eleggyel eluáljuk. 0,7 ml/min. sebességgel 6,1 ml-es frakciót fogunk fel. Az ultraibolya abszorpciós főcsúcs 298 nm-nél a 36—50. frakcióban jelenik meg, maximumot az 50-es frakciónál éri el. A 38-46-os frakciókat összeöntjük és az összeöntött frakciók 298 nm-nél összesen 107 abszorpciós egységet tartalmaznak. Az összeöntctt frakciókat csökkentett nyomáson rotációs bepárlóval bepároljuk 2 ml térfogatra és 5 /cd 1 M nátrium-hidroxidot adunk hozzá. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
