175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
39 175266 40 frakcióban van. Ezt a frakciót 18 literre koncentráljuk pH = 7 értéken és 0,45 mikron MiUipore szűrőn leszűrjük. A szűrletet tálcán liofilizáljuk, és ily módon 99 g 310 egység/mg aktivitású terméket kapunk. A liofilizált szilárd anyagból lOg-t 0,1 M 2,6-lutidin-acetát-pufferban veszünk fel, melynek pH-ja 6,3. A 125 ml oldat pH-ját ecetsav hozzáadásával 6,3-ra állítjuk vissza, és felvisszük egy Dowex 50 x 8 (200-400 mesh) 2,6-lutidin-ciklusú 7,6 x 142 cm méretű oszlopra, melyet előzőleg pufferral egyensúlyba hoztunk és 0,1 M pufferral hívjuk elő 25 ml/min sebességgel. Egy 3 literes előfrakciót fogunk fel, majd ezt 200, egyenként 20 ml-es frakció követi. A 36—192 frakciók közül minden negyediket teszteljük 1 :200 hígításban. Az 56-192 frakciók bioaktívak, a maximum a 92-96. frakciókra esik. A 80-136. frakciókat egyesítjük, és 590 ml ionmentes vizet öntünk hozzá, és ily módon 1760 ml oldatot kapunk. Az összeöntött felhígított oldat a Dowex 50 x 8 oszlopra felvitt bioaktivitás 62%-át tartalmazza. Ezt az oldatot liofilizáljuk. A liofilizált szilárd anyagot 0,1 M 2,6-lutidin-acetát 7-es pH-jú pufferben feloldjuk. A 27 ml oldatot Bio-Gel P-2 ( 2 00- 400 mesh) 5x112 cm-es oszlopra visszük fel, melyet előzőleg 0,1 M pufferral egyensúlyba hoztunk. A gélt ugyanezzel a pufferral hívjuk elő 10 ml/min sebességgel. A kiáramló folyadékot Mecco-matic regisztráló differenciális refraktométerrel követjük nyomon. Az előhívást addig folytatjuk, amíg 105, egyenként 20 ml-es frakciókat fel nem fogunk. A 70-93. frakciók mindegyikét teszteljük 1 :30u hígításban. A bioaktivitást a 73-82. frakciók mutatják, a maximum a 77. és a 78. frakcióban jelentkezik. A 75—80 frakciókat liofilizálju1 és 90 mg 10 000 egység/mg átlagos aktivitású antibiotikumot kapunk. A 90 mg liofilizált szilárd anyagot 4 ml 0,01 M kálium-foszfát pufferban (pH = 7) vesszük fel. Az 596 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó oldatot — a tienamicin tartalom mérését a tienamicin elemzési módszereinek II fejezetében írjuk le — 1,7 cm átmérőjű 90 ml előzetesen mosott XAD-2 gyantára visszük fel, melyet előzőleg 180 ml 0,01 M kálium-foszfát pufferral egyensúlyba hoztunk, pH = 7 értéken, 5 °C-on. A XAD-2 gyantát használat előtt egymás után 1/5 térfogat 1 n nátrium-hidroxiddal, majd ionmentes vízzel mossuk, amíg a kifolyó anyag semleges lesz, 2/5 térfogat 1 N sósavval és ionmentes vízzel, amíg a kifolyó anyag semleges lesz, 3/5 térfogatnyi metanollal, acetonnal, 0,001 M etilén-dinitril-tetra■ecetsav-tetranátrium-sóval, végül desztillált vízzel mossuk. Használat előtt minden oldószernél vákuumot alkalmazunk. Miután felvittük a mintát az oszlopra, kétszer 2 ml foszfát-puffer felvitele következik. Az oszlopot 5 °C-on 2 ml/min sebességgel hívjuk elő. Az eluátumból 4 ml-es frakciókat fogunk fel. Miután a 100 ml után kapott eluált frakciókat 253 ml-ig összegyűjtöttük, a frakciókat egyesítjük és vákuumban, 10 °C alatt, 6 ml-re besűrítjük rotációs bepárlóval. Ezt a 436 hidroxilamin-kíoltási optikai sűrűség egységet tartalmazó oldatot 1,7 cm-átmérőjü oszlopra visszük fel, amely 90 ml előzetesen mosott XAD-2 gyantából áll (mint fent) és amelyet előzőleg 5 °C-on desztillált vízzel egyensúlyba hoztunk. A minta után kétszer 2 ml desztillált vizet öntünk. Az oszlopot ezután desztillált vízzel hívjuk elő 2 ml/min sebességgel. Az eluátum 4 ml-es frakcióit fogjuk fel. Az eluátum 100-151. frakcióit összegyűjtjük, a kapott folyadékot összeöntjük és rotációs bepárlóval 2,73 ml térfogatra koncentráljuk, majd az oldatot liofilizálva 6,49 mg tienamicint kapunk. A 152—345. frakciókat egyesítjük és rotációs bepárlóban 3,34 ml-re koncentráljuk, liofilizáljuk és ily módon 11,53 mg antibiotikumot kapunk. Ezek a frakciók 369 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységet tartalmaznak. Ez 3,1-szeres tisztításnak felel meg az első XAD-2 gyanta-oszlopra felvitt anyaghoz viszonyítva és 31 000 egység/mg számított aktivitást kapunk. A termék mintájának színképelemzése szerint Ei = 253 foszfát pufferban, pH>= 7 értéknél, 297 nm-nél mérve. 99 g liofilizált szilárd termékből 10g-ot, melyet a fenti leírt Dowex 1x2 gyantán történő tisztítással kaptunk, 0,1 M 2,6-lutidin-acetát pufferban (pH = 6,3) veszünk fel. A 125 ml oldatot ecetsavval pH = 6,3-ra állítjuk be, az oldatot 7,6 x 142 cm méretű Dowex 50 x 8 2,6-lutidin-ciklusú oszlopra visszük fel, az oszlopot előzőleg a pufferral egyensúlyba hoztuk. Az oszlopot 0,1 M pufferral hívjuk elő 35 ml/min sebességgel. Egy 3,6 literes előfrakciót fogunk fel, melyet 200, egyenként 20 ml-es frakció követ. A 6-194-es frakciók közül 1 :200 hígításban minden negyedik frakciót tesztelésnek vetünk alá. Bioaktivitást a 18—178-as frakciók mutatnak, a maximum a 62-82-es frakciókban jelentkezik. A 42-102-es frakciókat egyesítjük és 640 ml ionmentes víz hozzáadásával 1920 ml oldatot kapunk. Az egyesített hígított oldatot, amely Dowex 50 x 8 oszlopra felvitt oldat bioaktivitásának 63%-át tartalmazza, liofilizáljuk. A liofilizált szilárd anyagot 0,1 M 2,6-lutidin-acetátban oldjuk fel (pH = 7). A 25 ml oldatot 5x112 cm Bio—Gel P—2 oszlopra (200—400 mesh) visszük fel, az oldatot előzőleg 0,1 M pufferral egyensúlyba hoztuk. A gélt ugyanezzel a pufferral hívjuk elő 10 ml/min sebességgel. A kiáramló folyadékot Mecco-matic regisztráló differenciális refraktométerrel követjük nyomon. Az előhívást addig folytatjuk, ameddig 125, egyenként 20 ml-es frakciót össze nem gyűjtünk. A 70—89-es frakciók mindegyikét 1 :300 hígításban teszteljük. A 72—81-es frakciók bioaktívak, a bioaktivitás a 77-es frakcióban éri el a maximumot. A 75—79-es frakciókat liofilizáljuk, és 100,5 mg 8320 egység/mg aktivitású antibiotikumot kapunk. A 100,5 mg liofilizált szilárd anyagot 4 ml pH = 7 értékű 0,01 M kálium-foszfát-pufferban vesszük fel. Ez az oldat 692 hidroxik min-kioltási optikai egységet tartalmaz. Az oldatot 1,7 cm átmérőjű 90 ml előzetesen mosott XAD-2 gyantával töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot használat előtt pH = 7 értéken és 5 °C-on 180 ml 0,01 M kálium-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
