175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
35 175266 36 A 4082 liter fermentlét 76,0 cm-es présszűrő és 4 súly/térfogat% szűrési segédanyag felhasználásával szűrjük. A szűrlethez 46 g etilén-dinitril-tetraecetsav nátriumsót adunk. A szűrletet 6 °C-ra lehűtjük, a pH-t 4 ,5±0,2 értékre állítjuk be, és a szűrletet 6 °C-on tartjuk. A hideg szűrletet 480 liter Dowex 50 x 4 Na+ 20—50 mes gyantán adszorbeáltatjuk 48 liter/min sebességgel. Miután egy 1400 literes előfrakciót áteresztünk, 18,9 liter szedünk, melynek pH értékét nátrium-hidroxiddal 7,08-ra állítjuk és 5 °C-on tároljuk. 300 ml Dowex 1 x 2, 50-100 mesh méretű klorid ciklusú gyantával töltött 3,8 cm átmérőjű oszlopot készítünk és 5 °C-on 300 ml ionmentes vízzel mossuk. Négy liter hideg Dowex 50x4 folyadékot folyatunk az oszlopon keresztül 30 ml/perc sebességgel. Az oszlopot 350 ml 25 juM EDTA-val mossuk. Az N-acetil-tienamicin antibiotikumot 5 °C-on 15 ml/min sebességgel eluáljuk 900 ml 5%-os nátriumklorid oldattal, amely 0,01 M trisz-hidrokloridot (pH = 7) és 25 juM EDTA-t tartalmaz. Egyenként 75 ml-es frakciókat gyűjtünk össze és megvizsgáljuk biológiai aktivitás szempontjából a lemez-diffúziós módszer segítségével Staphylococcus aureus ATCC 6538 P alkalmazásával. A bioaktivitás 47%-át tartalmazó 4—10-es frakciókat a bioelemzés céljából a 6. példában leírt első XAD-2 folyadékból félretett 42,5 ml-hez öntjük. Az egyesített frakciókat vákuumban 100ml-re koncentráljuk és a pH-t sósavval 6,32-re módosítjuk. 450 ml XAD—2-gyantával töltött 3,8 cm-es átmérőjű oszlopot egymás után 4 oszlopnyi térfogatú következő folyadékokkal mossuk elő: 1) 0,001M EDTA-val, 2) IN nátrium-hidroxiddal, 3) ionmentes vízzel, 4) IN sósavval, 5) ionmentes vízzel, 6) metanollal, 7) acetonnal, 8) ionmentes vízzel és használat előtt 2250 ml 25 /ÍM EDTA-t tartalmazó 5%-os nátrium-klorid oldattal. A fenti koncentrátumot a XAD—2 oszlopra visszük, majd kétszer 5 ml-es ionmentes vizet viszünk fel. Az oszlopot 5 °C-on hívjük elő 10 ml/min sebességgel ionmentes vízzel. Az első frakció 40ml-t tartalmaz, a következők pedig 75 ml-t, a frakciókat összegyűjtjük és lemez-diffúziós eljárással elemezzük. A bioaktivitás 22%-át tartalmazó 9-15 frakciókat XAD—2-oszlopra visszük fel, majd egyesítjük és vákuumban 56 ml-re koncentráljuk. 40 ml Dowex 1 x 4 klorid ciklusú (—400 mesh) gyantával (amelyet vízből való dekantálással határozunk meg) töltött 21 cm x 1,7 cm méretű oszlopot használat előtt 240 ml 0,2M 0,005M ammónium-kloridot és 0,1 mM ammónium-hidroxidot tartalmazó nátrium-kloriddal mosunk 1 ml/min sebességgel, majd azonos sebességgel 12 ml ionmentes vízzel mossuk. Az oszlopra felvitt XAD-2 koncentrátumot kétszer két ml ionmentes víz majd kétszer 2 ml eluáló puffer követi. Az oszlopot 5 °C-on 0,07 M 0,005 M ammónium-kloridot és 0,1 mM ammónium-hidroxidot tartalmazó nátrium-kloriddal eluáljuk 1 ml/min sebességgel 5 °C-on. 10 ml-es frakciókat fogunk fel és lemezdiffúziós módszerrel elemezünk. 544—647 ml-ig terjedő eluált frakciókat vizsgálunk, amelyek az alkalmazott bioaktivitás 100%-át tartalmazzák, a frakciókat egyesítjük és vákuumban 2,3 ml-re koncentráljuk. A koncentrátum 36,4 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmaz. 225 ml Bio-Gel P-2 (200—400 mesh), 1800 Dalton kizárási határ) gyantával töltött 2,2 x 62 cm méretű oszlopot használat előtt 225 ml 1M nátrium-kloriddal majd 100 ml ionmentes vízzel mosunk. A Dowex 1x4 koncentrátumot felvisszük az oszlopra, majd kétszer 2 ml adag ionmentes víz követi. Az oszlopot 5 °C-on ionmentes vízzel hívjuk elő 1 ml/perc sebességgel és 2 ml-es frakciókat fogunk fel, melyeket lemez-diffúziós elemzésnek vetünk alá. 7,04 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó 124-129. frakciókat egyesítünk és vákuumban 2 ml-térfogatúra bepároljuk és így az N-acetil-tienamicin termék vizes oldatát kapjuk. Összeöntjük a 117—123. és a 130—139. frakciókat és így 13,7 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó N-acetil-tienamicint kapunk. A termék 2. példa szerinti dezacetilezésével tienamicint kapunk. 8. példa Tienamicin előállítása Streptomyces cattleya MA-4297 törzs liofilizált tenyészetét tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitunk és tartalmát 50 ml steril A közeget tartalmazó inoculum tenyészet előállítására szolgáló 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban szuszpendáljuk. Az A táptalaj összetétele a következő: A táptalaj élesztő-autolízis termék (Ardamin*) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-puffer 2,0 ml magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz 1000 ml j>H: nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be. Ardamin: Yeast Products Corporation Foszfát-puffer oldat kálium-dihidrogén-foszfát 91,0 g dinátrium-hidrogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml A beoltott tenyészetet tartalmazó lombikot 28 °C-on 220 percenkénti fordulatszámú (5,08 cm löket) rázóberendezésben 48 óráig rázatjuk. A 48 óra múlva kapott fermentléből 40 ml-t aszeptikusán eltávolítunk és 40 ml steril 20 térfogat%-os glicerinnel összekeverjük. A kapott elegy 2ml-ét steril 1,772 g-os ampullákba pipettázzuk, megfagyasztjuk és cseppfolyós nitrogénfagyasztó gőzfázisában tároljuk. 50 ml A táptalajt tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikot beoltunk az ampullák megfagyott tartalmával. Ezt a beoltott tenyészetet tartalmazó lombikot 28 °C-on 24 óra hosszat rázatjuk 160 percenkénti fordulatszámú rázógépben. A beoltott tenyészetet tartalmazó lombikból 10 ml-es adagokkal beoltunk 500 ml A-táptalajt tar-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
