175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
31 175266 32 Kór (óra) PH ATCC 6633 0,945 cm-es lemez mm 0 6,9 0 24 6,3 0 36 6,0 0 48 5,9 0 60 6,0 23 72 5,9-84 6,0 21 96 6,2-108 6,5 35 120 6,6 36 132 6,7 41 138 6,7 39 A 4082 liter fermentlét 76,0 cm-es présszűrő és 4 súly/térfogat% szűrési segédanyag felhasználásával szűrjük. A szűrlethez 46 g (etilén-dinitril)-tetraecetsav nátriumsót adunk. A szűrletet 6 °C-ra lehűtjük, a opH-t 4,5:10,2 értékre állítjuk be, és a szűrletet 6 °C-on tartjuk. A hideg szűrletet 480 liter Dowex 50 x 4 Na* 20—50 mes gyantán adsz' oeáltatjuk 48 liter/min sebességgel. Miután egy 1400.literes előpárlati . áteresztünk, 18,9 litert szedünk, melynek pH értékét nátrium-hidroxiddal 7,08-ra állítjuk és 5 °C-,.n tároljuk. 300 ml Dowex 1 x2, 50 100 mes méretű klorid ciklusú gyantával töltött 3,8 cm átmérőjű oszlopot készítünk és 5 °C-on 600 ml ionmentes vízzel mossuk. Négy liter hideg Dowex 50 x 4 folyadékot folyatunk az oszlopon keresztül 30 ml/perc sebességgel. Az oszlopot 300 ml 25 pM EDTA-val mossuk. Az N-acetil-tienamicin antibiotikumot 5 °C-on 15 ml/min sebességgel eluáljuk 900 ml 5%-os nátriumklorid oldattal, amely 0,01 M kálium-foszfát puffert (pH = 7) és üM EDTA-t tartalmaz. Tizennégy, egyenként 75 ml-es frakciót gyűjtünk össze és megvizsgáljuk biológiai aktivitás szempontjából a lemez-diffúziós módszer segítségével. 525 ml 3-9 eluált frakciót egyesítünk és vákuumban koncentráljuk, a kapott folyadék 115 ml. A maradék a Dowex 1 x 2 klorid-oszlopra vitt összes bioaktív anyag 65%-át tartalmazza. A Dowex 1 x 2 klorid oszlopon eluált koncentrátumot 5 °C-on 3,8 cm átmérőjű 450 ml előmosott XAD—2-vel töltött oszlopra visszük. A XAD—2-t oszlopként egymás után négy oszlopnyi térfogat: 1) 0,001 M EDTA-val, 2) 1 N nátrium-hidroxiddal, 3) ionmentes vízzel 4) 1 N sósavval, 5) ionmentes vízzel, 6) metanollal, 7) acetonnái, 8) ionmentes vízzel és használat előtt 25 nM EDTA-t tartalmazó 2250 ml 5%-os nátrium-klorid oldattal mossuk. A mintát felvisszük az oszlopra, majd kétszer 25 ml vizet viszünk fel. Az oszlopot 5 öC-on ionmentes vízzel 10 ml/perc sebességgel hívjuk elő. Az első frakció 400 ml-t tartalmaz és még 11 75 ml-es további frakciót gyűjtünk össze. Az egyes frakciók pH-ját 6,9-7,13-ra állítjuk be IN nátrium-hidroxid vagy IN sósav hozzáadásával. A 3-9. frakciókat, melyek a XAD-2 oszlopra felvitt összes bioaktív anyag 46%-át tartalmazzák, egyesítjük és összesen 490 ml oldatot kapunk. 45 ml mintát félreteszünk a bio-elemzéshez, melyet a sztandard lemez-diffúziós módszerrel végzünk Staphylococcus aureus ATCC 6538P törzs alkalmazásával. A maradék 445 ml-t vákuumban 50 nú-re besűrítjük. Az 50 ml XAD-2-eluátum koncentrátumot 5 °C-on, 1,5 cm-es 40 ml előmosott Dowex 1x4 klorid-hoz ciklusú gyantával töltött oszlopra visszük 5 °C-on 1 ml/min sebességgel. A vízből dekantált Dowex 1x4 klorid ciklusú (-400 mesh) gyantát használat előtt 240 ml 0,2 M 0,005 ammónium-kloridot és 0,01 mM ammónium-hidroxidot tartalmazó 0,2 M nátrium-kloriddal 1 ml/min sebességgel oszlopon keresztül, majd azonos sebességgel 120 ml ionmentes vízzel mossuk. A mintát felvisszük az oszlopra, majd kétszer 5 ml ionmentes vizet viszünk fel. Az oszlopot 5 °C-on 0,92 ml/perc sebességgel 0,005 M ammónium-kloridot és 0,1 mM ammónium-hidroxidot tartalmazó 0,07 nátrium-kloriddal 5 °C-on hívjuk elő. 8,6-9,3 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. 600—710 ml-ig a kapott eluált frakciókat összegyűjtjük és összeöntjük és a Dowex 1x4 oszlopra felvitt összes bioaktív anyag 98%-át tartalmazó terméket kapunk. Ezt a terméket vákuumban 2 ml-nyire koncentráljuk. A Dowex 1x4 koncentrátumot 225 ml Bio-Gel P-2-vel (200-400 mesh, 1800 Dalton kizárási limit-desztillált vízből történő dekantálással határozzuk meg) töltött 2,2 cm-es átmérőjű oszlopra visszük. A Bio—Gel P-2 oszlopot használat előtt 225 ml 1M nátrium-klorid oldattal, majd 100 ml ionmentes vízzel mossuk. Az oszlopot 5 C-os ionmentes vízzel hívjuk elő 1 ml/min sebességgel és 2 ml-es frakciókat kapunk. A 104—128 ml-ig kapott eluátumokból eredő frakciókat, amelyek az összes Bio—Gel P—2 oszlopra felvitt bioaktív anyag 83%-át tartalmazzák, összeöntjük és 1,58 ml-re koncentráljuk. 1,6 cm x 27 cm-es 50 ml XAD—2 oszlopot állítunk elő és az oszlopot 200 ml 1 mM EDTA-val, IN nátrium-hidroxiddal, ionmentes vízzel, IN sósavval, metanollal, acetonnal és ionmentes vízzel előmossuk. A 44,4 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűségű egységet tartalmazó Bio—Gel P—2 koncentrátumot 5 °C-on XAD-2-oszlopra visszük, majd még két 2 ml-es adag ionmentes vizet viszünk fel az oszlopra. Az oszlopot 1 ml/perc sebességgel mossuk ionmentes vízzel, amíg a mosott anyag ultraibolya abszorpciós képessége 300 nm hullámhossznál 0,060-ra csökken. Az oszlopot 50%-os metanollal eluáljuk 1 ml/min sebességgel ionmentes vízben és 1 ml-es frakciókat szedünk. A 300 nm-nél 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
