175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
27 175266 28 Staphylococcus aureus 6538P teszt-organizmus éjszakai növekményét fermentlében +0,2% élesztőextraktumban fermentlével +0,2% élesztőextraktummai hígítjuk, hogy 660 nm-nél 60% áteresztőképessé gű szuszpenziót kapjunk. A szuszpenziót 2,0 g/liter Difco élesztőextraktummal kiegészített Difco tápagarhoz adjuk 47-48 °C-on és így egy liter agarban 33,2 ml szuszpenziót tartalmazó készítményt kapunk. Ennek a szuszpenziónak 40 ml-ét 22,5 cm x 22,5 cm méretű Petri-csészékbe öntjük, a csészéket hűtjük és 4 °C-on tartjuk a felhasználásig, azaz legfeljebb 5 napig. A vékonyrétegkromatográfiás lemezt eltávolítjuk és a próbatenyészetet éjjel 37 °C-on inkubáljuk. A nem-reagált 890 Ax -nek megfelelő folton kívül, amely Rf = 0,7—0,89-nél jelentkezik, bioaktív foltot figyeltünk meg a dezacetil 890 A i-nek megfelelően az Rf = 0,44—0,47-nél is. Kontroll inkubációs elegyek, amelyek antibiotikumot + puffért tartalmaznak és szonikusan bontott sejteket + puffert tartalmazó elegyek, nem adnak bioaktív anyagot Rf = 0,44—0,47-nél. 4. példa 890 A3 dezacetilezése A 890 A3 antibiotikumot a 3. példában leírt módszerrel dezacetilezzük, hogy dezacetil-890 A3-t állítsunk elő. 5. példa Dezacetil-890 At előállítása Hat, egyenként 50 ml C táptalajt tartalmazó 250ml-es Erlenmeyer lombikot beoltunk egy adag Protaminobacter ruber MB—3528 ferdetenyészetével. A C táptalaj összetétele a következő: dextróz 20 g Pharmamedia 8 g kukoricalekvár 5 g (nedves bázis) desztillált víz 1000 mi. a pH-t nátrium-hidroxid vagy sósav hozzáadásával 7-re állítjuk be. N-acetiletanolamin oldat 8,5 ml. Az N-acetiletanolamin oldat előállítása úgy történik, hogy az N-acetiletanolamint tízszeres menynyiségű vízzel hígítjuk és membrán-sterilizáljuk. Az oldatot csírátlanítás után a táptalaj többi részéhez adjuk. A lombikot 28 °C-on rázzuk 220 percenkénti fordulatszámmal (5,08 cm-es löket) működő rázóberendezésen 1 napig. Negyvenegy 2 literes 400 ml C táptalajt tartalmazó lombikot lombikonként 7 ml beoltott tenyészetet tartalmazó lombikokból származó növekménnyel oltunk be. Ezeket a lombikokat 28 °C-on rázatjuk 220 percentkénti fordulatszámú (5,08 cm-es löket) rázóberendezésen 6 napig. A lombikok tartalmát összeöntjük és 8 000 percenkénti fordulatszámmal 15 percig centrifugáljuk. A sejteket lekaparjuk a szilárd táptalajról és végül 1 600 ml térfogatú 0,05 M kálium-foszfát pufferbe öntjük, pH = 7,4. Ezt a szuszpenziót ismét centrifugáljuk 15 percig 8000 percenkénti fordulatszámmal. A sejteket a szilárd táptalajról ismét lekaparjuk egy 160 ml térfogatú 0,05 M kálium-foszfát pufferbe, pH = 7,4. A szuszpenziót lehűtjük 5 °C-ra és 15 ml-es alikvotokat egymást követően 15 másodperces ciklusokban ultrahangos besugárzásnak tesszük ki, az 1. példában leírt berendezés alkalmazásával, egészen addig, amíg nem tapasztaljuk a zavarosság további csökkenését, ha a szuszpenziót ötszázszorosára hígítjuk foszfát-puffer-konyhasó oldattal amelynek összetétele a következő: Foszfát-puffer-konyhasó oldat nátrium-klorid 8,8 g 1M foszfát-puffer, pH = 7,5 10 ml desztillált víz 1000 ml. 1M foszfát-puffer, pH = 7,5 16 ml 1M kálium-dihidrogénfoszfátot összekeverünk 84 ml 1M dikálium-hidrogénfoszfáttal. A foszfát-puffer pH-értékét kis mennyiségű 1M kálium-dihidrogénfoszfát vagy 1M dikálium-hidrogénfoszfát hozzáadásával 7,5-re állítjuk. Ehhez az elegyhez N-acetil-tienamicin amidohidrolázt tartalmazó Protaminobacter ruber 160 ml szonikus extraktumát adjuk. Az elegyet lassan keverjük mágneses keverővei 28 °C-on 20 óra hosszat. Az elegyet 10 000g-nél 15 percig centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk, 5 °C-ra hűtjük és a pH-t ecetsav hozzáadásával 4,5±-re állítjuk. A dezacetil 890 At antibiotikumot elválasztjuk a nem-hidrolizált antibiotikumtól és a reakcióelegy más komponenseitől. Az elválasztás lemez-diffúziós módszerrel történik Staphylococcus aureus ATCC 6538 alkalmazásával és a hidroxilamin-kioltási abszorpció méréseket 297 nm-nél arra használjuk, hogy rtyomon követhessük a tisztítási folyamatot. (L. a tienamicin vizsgálati módszereknél). A megsavanyított centrifugált reakcióelegyet 12ml/min sebességgel adszorbeáljuk egy 120 ml-es Dowex 50 x 4 nátrium ciklusú (20—50 mesh) gyanta ágyon. Az abszorbeált anyagot 120 ml ionmentes vízzel mossuk és 6 ml/min sebességgel 2%-os vizes piridinnel eluáljuk. Utóbbi eluálószer 75 ml-e lefolyik, az oszlopról, majd a következő 240 ml-t egyesítjük és 25 ml-re koncentráljuk, majd a koncentrátum pH-értékét 7-re állítjuk be. A 25 ml koncentrátumot 1 ml/min sebességgel adszorbeáljuk egy 25 ml-es klorid ciklusú Dowex-1 x 2, (50-100 mesh) gyanta ágyon. A gyantát azonos sebességgel ionmentes vízzel eluáljuk. Az oszlopról 25 ml eluálószer folyik le, a következő 50 ml-t egyesítjük, pH = 7-re állítjuk és 10 m!-re koncentráljuk. Ezt a koncentrátumot ecetsavval pH = 6,3 -ra igazítjuk és Dowex 50x8 (200-400 mesh) 2,6-lutidin ciklusú gyanta ágyra visszük, az ágy átmérője 1 cm, magassága 50 cm, melyet előzőleg 0,1 M 2,6-lutidin acetát pufferrel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
