175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
25 175266 26 deponáljuk. A Protaminobacter ruber MB -3528 ferdetenyészeten 1 létrejött növekmény egy részével beoltunk egy 50 ml C táptalajt tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikot. A C táptalaj összetétele a következő: C táptalaj dextróz 20 g Pharmamedia g g kukoricalekvár 5 g (nedves bázis) desztillált víz 1000 ml. kezik, bioaktív foltot figyeltünk meg a tienamicinnek megfelelően az Rf = 0,44-0,47-nél is. Kontroll inkubációs elegyek, amelyek antibiotikumot + puffert, szonikusan bontott sejtetet ♦ puffert és anti- 5 biotikum + puffert, melyhez a szonikusan bontott sejteket közvetlenül a vékonyrétegkromatográfia előtt adtuk, nem adnak bioaktív anyagot Rf = 0,44—0,47-nél. 3. példa A pH-t 7-re állítjuk be nátrium-hidroxid vagy sósav hozzáadásával N-acetiletanolamin oldat Az N-acetiletanolamint tízszeres mennyiségű vízben oldjuk és membrán-sterilizáljuk. Csírátlanítás után ezt az oldatot adjuk a C táptalaj többi komponenséhez. A lombikot 28 °C-on négy napig rázzuk egy 220 percenkénti fordulatszámú 5,08 cm löketű rázóberendezésen. A lombikból 25 ml-es adagot 15 percig centrifugálunk 8 000 percenkénti fordulatszámmal. A felülúszót eltávolítjuk és a szilárd. 25 táptalaj felületéről a sejteket 7,4 pH értékű 0,5 ml 0,05M kálium-foszfát puíferbe kaparjuk. A kapott szuszpenziót ultrahangos elbontásnak tesszük ki Branson Instrument Model LS—75 Sonifier készülék segítségével - melynek szondája 1,27 cm-es - 30 4 egymást követő 15 másodperces intervallumokban, miközben a szuszpenziót a bontás alatt és között jeges vízben hűtjük. A szonikát 1 G/ul-es adagját 2Sjj1 840/ig/ml N-acetil-tienamicin lOmM kálium foszfát pufferrel képezett elegyét tártál- 35 mazó oldatával elegyítjük (pH = 7) és éjjel inkubáljuk 28 °C-on. Antibiotikumot és csak puffert tartalmazó kontrollokat és szonikusan elbontott sejteket és antibiotikum nélküli puffert is alkalmazunk, kontrollként. 28 °C-on egész éjjel inku- 40 báljuk a kontrollokat és 2pl-es mennyiségeket cellulóz bevonatú vékonyrétegkromatográfiás lemezekre viszünk, melyeket etanol és víz 70:30 arányú elegyével hívunk elő. Levegőn szárítás után a vékonyrétegkromatográfiás lemezt Staphylococcus 45 aureus ATCC 6538P próba tenyészetre helyezzük 5 percre. A próbatenyészeteket a következő módon állítjuk elő: Staphylococcus aureus 6538P teszt-organizmus 50 éjszakai növekményét fermentlében +0,2% élesztő extraktumban fermentlével +0,2% élesztőextraktummal hígítjuk, hogy 660nm-nél 60% áteresztőképességű szuszpenziót kapjunk. A szuszpenziót 2,0g/Iiter Difco élesztőextraktummal kiegészített Difco 55 tápagarhoz adjuk 47-48 °C-on és így egy liter agarban 33,2 ml szuszpenziót tartalmazó készítményt kapunk. Ennek a szuszpenziónak 40 ml-ét 22,5 cm x 22,5 cm méretű Petri-csészékbe öntjük, a csészéket hűtjük és 4 °C-on tartjuk a felhasználásig, 60 azaz legfeljebb 5 napig. A vékonyrétegkromatográfiás lemezt eltávolítjuk és a próbatenyészetet éjjel 37 °C-on inkubáljuk. A nem-reagált bioaktív N-acetil-tienamicinnek megfelelő folton kívül, amely Rf = 0,7-0,89-nél jelent- 65 890 A] dezacetilezése Protaminobacter ruber MB-3528 ferdetenyészeten kialakított növekmény egy adagjával beoltunk egy 50 ml C táptalajt tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikot. A C táptalaj összetétele a következő: C táptalaj dextróz 20 g Pharmamedia 8 g kukoricalekvár 5 g (nedves bázis) desztillált víz. 1000 ml. pH-t nátrium-hidroxid és sósav hozzáadásával 7-re állítjuk be. N-aecetil etanolamin oldat Az N-acetil-etanolamin oldatot úgy állítjuk elő, hogy az N-acetil-etanolamint tízszeres mennyiségű vízben oldjuk és membrán-sterilizáljuk. Az oldatot csírátlanítás után a C táptalaj többi komponenséhez adjuk. A lombikot 28 °C-on négy napig rázatjuk egy 220 percenkénti fordulatszámú 5,08 cm löketű rázóberendezésen. A lombikból 25 ml-es adagot 15 percig centrifugálunk 8 000 percenkénti fordulatszámmal. A felülúszót eltávolítjuk és a szilárd táptalaj felületéről a sejteket 7,4 pH értékű 0,5 ml 0,05M kálium-foszfát pufferbe kaparjuk. A kapott szuszpenziót ultrahangos elbontásnak tesszük ki Branson Instrument Model LS-75 Sonifier készülék segítségével — melynek szondája 1,27 cm-es — 4 egymást követő 15 másodperces intervallumokban, miközben a szuszpenziót a bontás alatt és között jeges vízben hűtjük. A szonikát 10 /d-es adagját 25 fjl 840 pg/rnl 300 nm-nél 4,85 hidroxilamin-kioltó optikai egységet tartalmazó 890 A1 oldattal elegyítjük. Antibiotikumot és csak puffért tartalmazó kontrollokat és szonikusan elbontott sejteket és antibiotikum nélküli puffert is alkalmazunk, kontrollként. 28 °C-on egész éjjel inkubáljuk a kontrolokat és 2pl-es mennyiségeket cellulóz bevonatú vékonyrétegkromatográfiás lemezekre viszünk, melyeket etanol és víz 70:30 arányú elegyével hívunk elő. Levegőn szárítás után a vékonyrétegkromatográfiás lemezt Staphylococcus aureus ATCC 6538P próbatenyészetre helyezzük 5 percre. A próbatenyészeteket a következő módon állítjuk elő: 13
