175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
5 175265 6 A Streptomyces cattleya-t abból a szempontból is megvizsgáltuk, mennyire képes felhasználni vagy ?«7imi1álni a különböző szénhidrátokat. E célból a mikroorganizmust alap szintetikus közegben [Pridham és Gottlieb International Journal of Systematic Bacteriology, 16 kötet, 311. o. (1966)] tenyésztettük, amely 1% szénhidrátot tartalmazott, a tenyésztést 28 °C-on három hétig végeztük. A vizsgált közeg pH-ja közelítőleg semleges (6,8-7,2) volt. A 2. táblázat bemutatja a Streptomyces cattleya szénhidrát-forrásait: a + jel a jó növekedést jelenti, a ± a gyenge növekedést, és a - jel azt mutatja, hogy ezen a szénhidráton nem volt növekedés. 2. táblázat glükóz + maltóz ± arabinózmannit ± cellulózmannóz ± fruktóz ± raffinóz — inozitramnóz — laktózszacharin xilóz ± A mikroorganizmus növekedésének mértéke a következőképpen változik a hőmérséklet-, az oxigén-szükséglet és a nitrát hatásának a változásával: Hőmérséklet határok (élesztő-extraktum-glükóz + sók agar): 28 °C - jó 37 °C — közepes 50 °C - nincs növekedés. Oxigén-szükséglet („Stab’’-tenyészet, élesztő-extraktum-glükóz + sók agarban): aerob, nitrát-redukció — pozitív. Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti új antibiotikum előállítása nem csupán a Streptomyces cattleya organizmushoz kapcsolódik, vagy olyan organizmusokhoz, amelyek a fent megadott mikroszkopikus és növekedési jellemzőket mutatják, mert ezek csak illusztratív jellegűek. A találmány tárgyát képezi a fentiekben leírt mikroorganizmus különböző módokon képezett mutánsainak, például Röntgen-sugárzással, ultraibolya-sugárzással, nitrogén-mustárral, bakteriofág-behatással és hasonlóan kapott mutánsoknak az alkalmazása is. A találmány szerinti, új antibiotikumot, az N-acetil-tienamicint, valamely szokásos vizes tápközegben, szabályozott reakciókörülmények között végzett aerob fermentációval, a Streptomyces cattleya mikroorganizmussal történt beoltás útján állítjuk elő. Vizes tápközegként alkalmazhatunk bármely olyan tápközeget, amelyet más antibiotikum tenyésztésénél használnak. Ez a tápközeg szén-, nitrogén- és szervetlen só-forrásokat tartalmaz, amelyeket a mikroorganizmus asszimilálni képes. Szénhidrátokként általában például cukrokat, mint glükózt, fruktózt, szacharózt, xilózt, mannitot és hasonlókat használunk, valamint keményítőket, példáid gabona- például zab-, tözs-, kukorica-keményítőt, kukorica-lisztet és hasonlókat alkalmazhatunk önmagukban vagy kombinálva a tápközeg asszimilálható szén-forrásaként. A felhasznált szénhidrát-forrás vagy -források pontos mennyisége a tápközegben részben függ a tápközeg többi alkotórészeitől, de általában a szénhidrát-mennyiség a tápközegben 1—6% szokott lenni. Az említett szén-forrásokat használhatjuk önmagukban, de kombinálhatjuk is őket a tápközegben. Általában számos fehérjetartalmú anyagot alkalmazhatunk a fermentációs eljárás nitrogén-forrásaként. Alkalmas nitrogén-források például az élesztő-hidrolizátumok, egész élesztősejtek, szójabab-liszt, gyapotmag-liszt, kazein-hidrolizátumok, kukorica-lekvár, desztillálási maradékok vagy paradicsom-pép és hasonlók. Az említett nitrogén-forrásokat alkalmazhatjuk önmagukban vagy egymással kombinálva, 0,2-6 súly%-ban, a vizes tápközegre számítva. A tápközegben alkalmazható szervetlen sók, melyek beépülnek a tenyésztőközegbe például azok, amelyek a következő ionokat szolgáltatják: nátrium-, kálium-, ammonium-, kalcium-, foszfát-, szulfát-, klorid-, karbonát- és hasonló ionokat. A felsorolásba beleértendő a kobalt-, mangán-, vas- és magnézium-nyomok is. Megjegyezzük, hogy a fentiekben ismertetett tápközegek csak annak illusztrálására szolgálnak, hogy milyen széles variációjú az alkalmazható tápközeg, és nem jelentenek semmiféle korlátozást. A fermentációt 20—37 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Optimális eredmények elérése céljából azonban fermentációs hőmérsékletként 22—30 °C-t alkalmazunk. A tápközeg pH-ja, amelyben a Streptomyces cattleya megfelelően tenyészthető, és így N-acetil tienamicin keletkezik, 6,0-8,0 lehet. Az új antibiotikum, az N-acetil tienamicin ugyan előállítható mind felületi, mind pedig süllyesztett tenyésztéssel, a fermentációt előnyösen a süllyesztett módszerrel végezzük. Az új antibiotikum előállítását laboratóriumi méretű fermentáció segítségével úgy végezzük, hogy a megfelelő tápközeget beoltjuk az antibiotikumot képző tenyészettel, majd áthelyezzük úgynevezett előállítási tápközegbe, és a fermentációt mintegy 24 °C-on, a hőmérsékletet állandó értéken tartva, néhány napig rázógépben végezzük. A fermentációt sterilizált lombikban indítjuk be, a tápközegben egy- vagy több lépésben előállítva az oltási tenyészetet. Az erre alkalmazható tápközeg bármely megfelelő szén- és nitrogén-forrás-kombináció lehet. Az oltási tenyészetet tartalmazó lombikot állandó hőmérsékletű helyiségben, mintegy 28 °C-on 2 napig rázzuk, illetve addig, ameddig megfelelő a tenyészet-növekedés, és a kapott tenyészetet vagy arra használjuk, hogy beoltsuk vele a második fázisú oltási tenyészetet, vagy az úgynevezett előállítási tápközeget. Ha közbenső úgynevezett oltási tenyészetet tartalmazó lombikokat használunk, úgy ezekben a tenyészetet lényegé5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
