175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
7 175265 S ben azonos módon tenyésztjük tovább, vagyis az utolsó oltási tenyészetet tartalmazó lombik tartalmának egy részét alkalmazzuk az előállítási tápközeg beoltására. A beoltott tenyészetet tartalmazó lombikokat állandó hőmérsékleten néhány napig keverjük, és az inkubációs periódus befejeztével a lombik tartalmát centrifugáljuk vagy szűrjük. Ha nagyipari méretekben végezzük a tenyésztést, úgy a fermentációt előnyösen valamely megfelelő keverővei és a tápközeget levegőztető berendezéssel ellátott tartályban végezzük. Ennél a módszernél a tápközeget a tartályban készítjük el, és mintegy 120 °C hőmérsékletig hevítve sterilizáljuk. Hűtés után a sterilizált tápközeget beoltjuk az előzetesen elkészített úgynevezett előállítási tenyészet egy részével, és a fermentációt keverés és/vagy levegőztetés közben egy ideig, például 3-5 napig folytatjuk, miközben a hőmérsékletet állandóan mintegy 24°C-on tartjuk. Ezt a módszert különösen nagy mennyiségű N-acetil-tienamicin antibiotikum előállítására alkalmazhatjuk. Az N-acetil-trenamicin fizikai és kémiai tulajdonságai: 100 MHz-nél az N-acetil-tienamicin NMR spektruma a következő csúcsokat mutatta: 5 1,27, d, 3H, JM>,5 6 1,98, S, 3H, ő 2,94 m, 2H, 5 3,17, m 2H, 53,38, t, 2H, J=*6,5, 5 3,38, m, 1H, 54,20, m, 2H. A fermentálással és a tienamicin acetilezésével kapott N-acetil-tienamicin egyesített oldatának NMR spektruma nem különböztethető meg az egyes oldatok NMR spektrumától. A Xmax pH függvényből az N-acetil-tienamicin COOH csoportjára pKa = 3,3±0,1 értéket határoztuk meg. 0,1 M kálium-foszfát pufferben Schleicher és Schuell 2043-B papírral 50v/cm feszültség gradiensnél papír elektroforézis során a fermentálással és a tienamicin acetilezésével kapott N-acetil-tienamicin 2,7 cm-nyit vándorol az anód felé 20 percen keresztül 10ÄC-on. Az antibiotikumot bioautográfia segítségével lokalizáljuk Vibrio percolans ATCC 8461 organizmussal beoltva (a papír közbenső szárítása nélkül) és mérjük a vándorlást az alkalmazás pontja és a gátlási zóna központja között. Vékonyrétegtaromatográfiás vizsgálatok során cellulózzal bevont lemezeket és etanol és víz 70 :30 arányú oldószerrendszert használunk és a fermentálással és a tienamicin acetilezésével kapott N-acetil-tienamicin Rf értéke 0,7, amint ezt a Vibrio percolans ATCC 8461 törzzsel végzett bioautográfia is mutatja. Az Rf érték a bioaktivitás centruma és az eredeti hely közötti távolság osztva az eredeti hely és az oldószer front közötti távolsággal. Az N-acetil-tienamicin IR spektrumát az 1. ábra mutatja. Az N-acetil-tienamicin feltételezhetően az I általános képlettel jellemezhető. Az N-acetil-tienamicin a következő antibiotikus spektrum profillal jellemezhető tovább. A teszt módszer során a Bauer—Kirby lemez-diffúziós módszert mindössze annyiban módosítjuk, hogy 2 mm agai mélységet alkalmazunk. A gátlózóna mm-ben kifejezett átmérőjével jellemzett eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. A 3. táblázat az N-acetil-tienamicin és a tienamicin acetilezésével kapott anyag antibiotikus spektrum profilját mutatja. Az N-acetil-tienamicin in vivo hatást gyakorol a Gram-negatív és Gram-pozitív mikroorganizmusokra, és ezért alkalmas a gazda-állatok baktérium-fertőzésének a leküzdésére. Az in vivo hatás meghatározására az N-acetil-tienamicint feloldjuk és 0,01 M nátrium-foszfáttal hígítjuk, a pH = 7,0 és ily módon öt sorozat vizsgálati antibiotikum-oldatot kapunk, ahol minden egyes sorozat az előbbi koncentrációjának az 1/4-e. Fehér, átlagosan 21 g-os nőstény svájci egereket intraperitoneálisan fertőzünk a teszt-mikroorganizmussal, amelyet* fermentlében szuszpendálunk. Az injektált organizmusok számát sztandard lemez-számláló módszerrel határozzuk meg. Bizonyos mennyiségű egeret a fertőzéskor, majd 6 órával ezután is intraperitoneálisan kezelünk az antibiotikummal. Minden egyes antibiotikum-koncentrációhoz 5 egeret alkalmazunk. Kontrollként különböző hígítású fertőző-tenyészethez 5-5 egeret alkalmazunk annak kiszámítására, hogy a fertőzött, kezeletlen állatok 50%-ára milyen számú organizmus letális (LD50). Ezt a számítást úgy végezzük, hogy megállapítjuk, hogy hány egér marad életben a fertőzést követő hetedik napon. Ekkor kiszámítjuk azt az antibiotikum-mennyiséget is, amely a fertőzött egerek 50%-ának (EDS0) megvédéséhez szükséges. A fenti módon fertőzött, de antibiotikummal nem kezelt állatok mindegyike elpusztul a fertőzést követő 48 órán belül. A 4. táblázat az N-acetil-tienamicin hatásosságát szemlélteti: 4. táblázat Hatásossági vizsgálatok (egéren)* * 8 Organizmus LD50 Kezelési EDS0 mód, mg/kg adagok adage Staphylococcus aureus 2949 13 i.p. x 2b 0,050 8CD-1, nőstény egerek, testsúly 21 g b a kezelés a fertőző dózis beadásakor 6 órával később történik. cWt. A 96%-os tiszta anyag becsült E}^mi 301 nm = 290 és hidroxilamin kioltó képességen alapuló súly. Az N-acetil-tienamicin igen értékes antibiotikum a különböző Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben, és ennek következtében gyógyszerként alkalmazhatjuk mind az ember-, mind az állatgyógyászatban. A találmány szerint előállított vegyületet felhasználhatjuk a Gram-pozitív vagy Gram-negatív baktériumok okozta fertőzések kezelésére, például a Staphylococcus aureus,, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae és Enterobacter cloacae ellen. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
