175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
35 175265 36 kétszer 1 ml ionmentes vízzel mossuk 0,6 ml/min áramlási sebességgel. 3,04 ml-es frakciókat kapunk. 300 nm-nél az ultraibolya abszorpciós főcsúcs az 58—64. frakciókban jelentkezik és a maximumot a 60. frakciónál éri el. A 83,7 A30o egységet tartalmazó 59-62. frakciókat összeöntjük. 2,2A300 egységgel ekvivalens adagot referencia-alapnak eltávolítjuk és a maradékot 1,5 ml térfogatra koncentráljuk, 14 ml-es üvegampullában liofilizáljuk és így 3,9 mg N-acetil-tienamicint kapunk. \nax30! nm, Emax/Emin=4,45, E%30, ionmentes vízben = 208 7. példa Tienamicin acetilezése A lépés Kilenc mg tienamicint 10 percig keverünk 0 °C-on 1 ml száraz dimetilformamid és 2 ml frissen készített ecetsavanhidrid elegyében. A dimetilformamidot és az ecetsavanhidridet 5—6-szori mosással távoli tjük el. A mosást 25—40 ml hexán adagokkal és 1 ml száraz etiléter hozzáadása után egy utolsó adag hexánnal végezzük. 50 /cil 1 M trisz-bázist és 50 /cd 1 M trisz—HCl-t tartalmazó 10 ml hideg desztillált vizet adunk hozzá pH = 8 értéken. A kapott oldat pH-ja 7,8 és összesen 102 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmaz. 10 ml hideg desztillált vizet adunk hozzá és az oldatot 0 °C-on tartjuk. 30 ml Dowex 1 x 4 klorid ciklusú (mínusz 400 mesh) gyantával töltött 1,7 cm átmérőjű oszlopot készítünk és 90 ml térfogatú oldatokkal mossuk a következő sorrendben: 0,2 M sósavval, 0,5 N nátrium-klorid oldattal, amely 0,01 M sósavat tartalmaz, majd ionmentes vízzel. A Dowex 1 x 4 oszlopra 20 ml mintát viszünk fel, majd ezt követi kétszer 2 ml ionmentes víz és kétszer 1 ml eluáló puffer. Az oszlopot 0,005 M ammóniumkloridot és 0,1 mM ammóniumhidroxidot tartalmazó 0,07 M nátrium-kloriddal eluáljuk. 4,3 ml/5 perc sebességgel eluáljuk és 4,3 ml-es frakciókat fogunk fel. Az 555 ml—594 ml-ig a frakciókat összeöntjük és 5 °C-on tároljuk. B lépés 27 mg tienamicint 10 percig keverünk 0 °C-on 2 ml száraz dimetilformamid és 4 ml frissen készített ecetsavanhidrid elegyében. A dimetilformamidot és az ecetsavanhidridet 6-szor 25—40 ml hexánnal, majd 2 ml száraz dietiléter hozzáadása után még egy adag hexánnal mossuk. 50 ß 1 M trisz-bázist és 50 m1 1 M trisz HCl-t (pH = 8) tartalmazó 10 ml hideg desztillált vizet adunk hozzá és a kapott oldat pH értéke 6,85. Az oldat 148 hidroxilamin kioltási optikai egységet tartalmaz. Az A lépésnél leírt Dowex 1x4 (mínusz 400 mesh oszlop) felső 1 cm-ét eltávolítjuk és az oszlopot 90 ml 0,2 M sósavval, 0,5 N 0,01 M sósavat tartalmazó nátrium-klorid oldattal, majd ionmentes vízzel mossuk. 10 ml elegyet hozzáadunk 10 ml 0 °C-os desztillált vízhez és Dowex 1 x 4 klorid ciklusú oszlopra visszük, majd az oszlopra kétszer 2 ml ionmentes vizet, majd 2 x 2 ml eluáló puffert viszünk. Az oszlopot 0,005 M ammóniumkloridot és 0,1 mM ammóniun.-hidrcxidot tartalmazó 0,07 M nátrium-kloriddal eluáljuk. 4,3 ml/5 perc sebességgel eluálunk és a kapott frakciók 4,3 ml-t tartalmaznak. A 497—571 ml-es frakciókat összeöntjük és a Dowex 1 x 4 oszlopról származó összeöntött frakciókhoz (A lépés) öntjük. Ezek a frakciók összesen 117,5 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmaznak. 225 ml Bio—Gel P—2 (200—400 mesh) gyantával, melynek kizárási határa 2600 Dalton, (desztillált vízből történő dekantálással határozzuk meg használat előtt) töltött 2,2 cm x 62 cm méretű oszlopot állítunk elő és 50 ml 1 M nátrium-kloriddal, majd 225 ml ionmentes vízzel mossuk. Az egyesített Dowex 1 x 4 eluált frakciókat vákuumban 2,66 ml-re sűrítjük és Bio-Gel P-2 oszlopra visszük, majd kétszer 2 ml ionmentes vizet viszünk fel az oszlopra. Az oszlopot vízzel 1 ml/min sebességgel hívjuk elő és 2 ml-es frakciókat kapunk. A 190 ml—204 ml frakciókat felfogjuk, összeöntjük és 2,5 - ml-re sűrítjük. Egy 2,2 cm x 62 cm méretű 225 ml Bio-Gel P-2 (poliakrilamid polimer) (200—400 mesh, desztillált vízből történő dekantálással meghatározva, a kizárási határ 1600 Dalton) gyantával töltött oszlopot használat előtt 225 ml 1 M nátrium-kloriddal, majd 100 ml ionmentes vízzel mosunk. A fenti 109,5 hidroxilamin kioltási optikai egységet tartalmazó 2,5 ml koncentrátumot az oszlopra visszük, majd kétszer 2 ml ionmentes vizet viszünk az oszlopra. Az oszlopot ionmentes vízzel hívjuk elő 1 ml/min sebességgel és 2 ml-es frakciókat fogunk fel. A 104—132 ml-es frakciókat egyesítjük és az összeöntött oldat 97 hidroxilamin kioltási optikai egységet tartalmaz. Egy 2,4 ml-es adagot 0 C-on tartunk in vitro kísérletek céljából és a maradékot liofilizálva N-acetil-tienamicint kapunk. Az antibiotikumot tartalmazó készítményeket többféle dózisegység formában, például szilárd vagy folyékony, orálisan bevihető formában adagolhatjuk. A készítmények akár folyékonyak, akár szilárdak, dózis-egységenként 0,1-99%, előnyösen 10-60% hatóanyagot tartalmazhatnak. A készítmény általában az összsúlyra számítva 250-1000- mg hatóanyagot tartalmaz, azonban általában előnyös, ha a dózis mennyisége 250-1000 mg között, vagy még előnyösebben 400—800 mg között van. Parenterális adagolásnál a dózis egység rendszerint maga a tiszta vegyület enyhén savas steril vizes oldatban vagy oldható por formájában. A következő módon állítjuk elő az egyes kikészítési formákat: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
