175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
33 175265 34 pH = 7 értéken és 5 °C-on 180 ml 0,01 M kálium-foszfát pufferral egyensúlyba hoztuk. A XAD-2 gyantát használat előtt a következőképpen mostuk: 1. 5 térfogat 1 N nátrium-hidroxiddal, majd ionmentes vízzel, ameddig a kifolyó anyag semleges lesz, 2. 5 térfogat 1 N sósavval, majd ionmentes vízzel, ameddig a kifolyó anyag semleges lesz. 3. majd 5 térfogat metanollal, acetonnal, 0,001 M (etilén-dinitril)-tetraecetsav-tetranátrium sóval, végül desztillált vízzel. Használat előtt valamennyi oldószert vákuum-desztillációval tisztítunk. Miután a mintát felvittük az oszlopra, 2 x 2 ml foszfát-puffért viszünk az oszlopra. Az oszlopot 5 C-on a pufferrel 2 ml/min áramlási sebességgel hívjuk elő. Az eluátum 4 ml-es frakcióit összegyűjtjük. A frakciókat 109—309 ml-ig összegyűjtjük és egyesítjük. Ehhez az egyesített eluátumhoz adjuk a 6-os példa szerinti XAD—2 gyanta oszlopon tisztított 11,53 mg antibiotikumot, amely 186 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységű. Az egyesített eluátumot a hozzáadott antibiotikummal együtt vákuumban rotációs bepárlóban 10 °C alatti hőmérsékleten 7 ml térfogatra sűrítjük be. A 720 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó oldatot 1,7 cm átmérőjű 90 ml előzetesen a fentiek szerint mosott XAD-2 gyantával töltött oszlopra visszük fel, az oszlopot használat előtt 5 °C-on desztillált vízzel egyensúlyba hoztuk. A minta után 2 x 2 ml desztillált vizet adagolunk. Az oszlopot 2 ml/min sebességgel desztillált vízzel hívjuk elő. Az eluátumból 4 ml-es frakciókat fogunk fel. A 109—301 ml között kapott frakciókat egyesítjük, és rotációs bepárlóban 10,3 ml térfogatra koncentráljuk. Az 589 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó oldatot liofilizáljuk és 30,140 egység/mg számított aktivitású 23,6 mg antibiotikumot kapunk. Az így előállított antibiotikum fehér, amorf szálas anyag. Ha a kapott anyag egy mintáját üveg kapillárisban 3 °C/perc sebességgel melegítjük az anyag a folyékony fázist kihagyva a következő fokozatokban bomlik fel: 130-140 °C-ig lágyulás következik be, miközben a szilárd anyag térfogatában összehúzódik, ez a kontrakció 170-174 C-ig tart, eközben az anyag megsárgul, összezsugorodik, majd fokozatosan intenzívebb színű lesz, 180- —200 °C-ig pirosas-barna színeződést figyeltünk meg, végül az anyag elszenesedik, és 205 °C-nál szilárd anyag-nyomok maradnak. Ennek az anyagnak egy további mintáját spektrofotometriásán analizáljuk, az elemzés során az abszorpciós csúcs 296,5 nm-nél figyelhető meg, E}^m,= 268,2. Az elemanalízis a következő eredményeket adja: 1. Szobahőmérsékleten vákuumban 4 óra hoszszat szárítjuk az anyagot, az ennek következtében fellépő súlyveszteség 5,67%. 2. összetétel: C =47,68%, H = 6,22%, N =11,48%. Ezek az eredmények a következő tapasztalati képletnek felelnek meg: CMHi6N204S (MH3)0 28. A tapasztalati képletnek megfelelő számított összetétel: C =47,68%, H =6,13%, N = 11,52%, S =11,57% és O =23,1%. Ugyanennek a mintának 1 mg/ml töménységű oldatát lOmM kálium-foszfát pufferban polarimetriásan elemezve a fajlagos optikai forgatóképesség [aß7°C + 80. A nujolos minta infravörös sepktruma a karakterisztikus abszorpciós csúcsokat 1765 cm“1, 1650— 1550 cm'1, 2800—2500 cm“1 és 3500- -3100cm“1 értékeknél mutatja. A termék D20- -ban oldott mintája 100MHz-nél a következő NMR-spektrumot mutatja: S = 1,275-nél dublett, ő = 3,39-nél egy dublett pár és S = 3,15 és 5 =4,20- -nál multiplett jelentkezik, ezek a csúcsok jellemzőek a tienamicinra. 6. példa A tienamicin acetilezése 10,9 mg tienamicint 10 percig kevertetünk 0 °C-on 1 ml száraz dimetilformamid és 2 ml frissen készített ecetsavanhidrid elegyében. A dimetilformamidot és ecetsavanhidridet 5—6 alkalommal ismételt 25—40 ml hexánnal történő mosással és 1 ml száraz dietiléter hozzáadása után még egy utolsó adag hexánnal történő mosással távolítjuk el. Az N-acetil-tienamicin nyers mintát 20 ml 100/rmól trisz-bázistftri s z( hidroximetil)amino-metán t ] és 35 /intól sósavat tartalmazó ionmetes vízzel oldjuk. A minta feloldása után a pH = 7,9. Az oldat 298 nm-nél 244 abszorpciós egységet tartalmaz és egy 0,1 ml 1000-szeres hígítású oldatot tartalmazó 1,127 cm-es kísérleti tenyészet 23 mm-es gátlási zónát ad 25 °C-on ATCC 8461 tenyészetek inkubálása hatására. Ezt a mintát 1,3 cm x 14 cm ágyméretű Dowex 1 x 4 klorid ciklusban dolgozó mínusz 400 mesh méretű gyantával töltött oszlopra visszük. Az oszlopot 10 ml ionmetes vízzel mossuk és az N-acetil-tienamicint iomentes vízben oldott 0,07 M nátrium-kloridot, 0,005 M ammónium-kloridot és 0,0001 M ammóniát tartalmazó eleggyel eluáljuk. 0,7 ml/min sebességgel 6,1 ml-es frakciókat fogunk fel. Az ultraibolya abszorpciós főcsúcs 298 nm-nél a 36—50. frakciókban jelenik meg, maximumot az 50-es frakciónál éri el. A 38-46-os frakciókat összeöntjük és az összeöntött frakciók 298 nm-nél összesen 107 abszorpciós egységet tartalmaznak. Az összeöntött frakciókat csökkentett nyomáson rotációs bepárlóval bepároljuk 2 ml térfogatra és 5 /d 1 M nátrium-hidroxidot adunk hozzá. Ezt a koncentrátumot 2,2 x 80 cm ágy-dimenziójú Bio—Gel P—2-vel (poliakrilamid polimer) (200- —400 mesh) töltött oszlopra visszük fel. A mintát 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
