175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
31 175265 32 70 literes frakcióban van. Ezt a frakciót 18 literre koncentráljuk pH = 7 értéken és 0,45 mikronos Millipore szűrőn leszűrjük. A szűrletet tálcán liofilizáljuk, és ily módon 99 g 310 egység/mg aktivitású terméket kapunk. Egységnyi mennyiségben értjük a Staphylococcus aureus ATCC 6538P törzzsel lemez-diffúziós eljárással elért gátlást, amely 1 /ag cefalotin/ml-rel elért gátlással egyenértékű (a gátlási zóna az átmérő 16. és 21 mm-e között van). A liofilizált szilárd anyagból lOg-t 0,1 M 2,6-lutidin-acetát-pufferban veszünk fel, melynek pH-ja 6,3. A 125 ml oldat pH-ját ecetsav hozzáadásával 6,3-ra állítjuk vissza, és felvisszük egy Dowex 50 x 8 (200-400 mesh) 2,6-lutidin-ciklusú 7,6 x 142 cm méretű oszlopra, melyet előzőleg pufferral egyensúlyba hoztunk és 0,1 M pufferral hívjuk elő 25 ml/min sebességgel. Egy 3 literes előfrakciót fogunk fel, majd ezt 200, egyenként 20 ml-es frakció követi. A 36—192. frakciók közül minden negyediket teszteljük 1 :200 hígításban. Az 56—192-es frakciók a bioaktívak, a maximum a 92-96. frakcióra esik. A 80-136. frakciókat egyesítjük, 590 ml ionmentes vizet öntünk hozzá, és ily módon 1760 ml oldatot kapunk. Az összeöntött, felhígított oldat a Dowex 50 x 8 oszlopra felvitt bioaktivitás 62%-át tartalmazza. Ezt az oldatot líofilizáljuk. A liofilizált szilárd anyagot 0,1 M 2,6-lutidin-acetát 7-es pH-jú pufferben feloldjuk. A 27 ml oldatot Bio-Gel P—2 (200—400 mesh) 5x112 cm-es oszlopra visszük fel, melyet előzőleg 0,1 M pufferral egyensúlyba hoztunk. A gélt a pufferral hívjuk elő 10 ml/min sebességgel. A kiáramló folyadékot Mecco-matic regisztráló differenciális refraktomérettel követjük nyomon. Az előhívást addig folytatjuk, amíg 105, egyenként 20 ml-es frakciókat fel nem fogunk. A 70—93. frakciók mindegyikét teszteljük 1 :300 hígításban. A bioaktivitást a 73-82. frakciók mutatják, a maximum a 77. és a 78. frakcióba jelentkezik. A 75-80. frakciókat líofilizáljuk és 90 mg 10 000 egység/mg átlagos aktivitású antibiotikumot kapunk. A 90 mg liofilizált szilárd anyagot 4 ml 0,01 M kálium-foszfát pufferben (pH = 7) vesszük fel. Az 596 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó oldatot (a tienamicin tartalom mérését a példa végén újuk le) 1,7 cm átmérőjű 90 ml előzetesen mosott XAD—2 gyantára visszük fel, melyet előzőleg 180 ml 0,01 M kálium-foszfát pufferrel egyesúlyba hoztunk, pH = 7 értéken, 5 °C-on. A XAD—2 gyantát használat előtt egymás után 1/5 térfogat 1 N nátrium-hidroxiddai, majd ionmentes vízzel mossuk, amíg a kifolyó anyag semleges lesz, 2/5 térfogat 1 N sósavval és ionmentes vízzel, amíg a kifolyó anyag semleges lesz, 3/5 térfogatnyi metanollal, acetonnal, 0,001 M etilén-dinitril-tetraecetsav-tetranátrium-sóval, végül desztillált vízzel mossuk. Használat előtt minden oldószert vákuum-desztillációval tisztítunk. Miután felvittük a mintát az oszlopra, kétszer 2 ml foszfát-puffer felvitele következik. Az oszlopot 5 °C-on 2 ml/min sebességgel hívjuk elő. Az eluátumból 4 ml-es frakciókat fogunk fel. Miután a 100 ml után kapott frakciókat 253 ml-ig összegyűjtöttük, a frakciókat egyesítjük és vákuumban, 10 °C alatt, 6 ml-re besűrítjük rotációs bepárlóval. Ezt a 436 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó oldatot 1,7 cm átmérőjű oszlopra visszük fel, amely 90 ml előzetesen mosott XAD—2 gyantából áll (mint fent) és amelyet előzőleg 5 °C-on desztillált vízzel egyensúlyba hoztunk. A minta után kétszer 2 ml desztillált vizet öntünk hozzá. Az oszlopot ezután desztillált vízzel hívjuk elő 2 ml/min sebességgel. Az eluátum 4 ml-es frakcióit fogjuk fel. Az eluátum 100-151. frakcióit összegyűjtjük, a kapott folyadékot összeöntjük és rotációs bepárlóval 2,73 ml térfogatra koncentráljuk, majd az oldatot liofilizálva 6,49 mg tienamicint kapunk. A 152 ml és a 345 ml között kapott frakciókat egyesítjük és rotációs bepárlóban 3,34 ml-re koncentráljuk, líofilizáljuk és ily módon 11,53 mg antibiotikumot kapunk. Ezek a frakciók 369 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységet tartalmaznak. Ez 3,1-szeres tisztításnak felel meg az első XAD 2 gyanta oszlopra felvitt anyaghoz viszonyítva és 31 000 egység/mg számított aktivitást kapunk. A termék mintájának színképelemzése szerint Ej^m = 253 foszfát pufferban, pH = 7 értéknél, 297 nm-nél mérve. 99 g liofilizált szilárd termékből 10g-ot melyet a fent leírt Dowex 1 x 2 gyantán történő tisztítással kaptunk, 0,1 M 2,6-lutidin-acetát pufferban (pH = 6,3) veszünk fel. A 125 ml oldatot ecetsavval pH = 6,3-ra állítjuk be, az oldatot 7,6 x 142 cm méretű Dowex 50 x 8 2,6-lutidin-ciklusú oszlopra visszük fel, az oszlopot előzőleg a pufferral egyensúlyba hoztuk. Az oszlopot 0,1 M pufferral hívjuk elő 35 ml/min sebességgel. Egy 3,6 literes előfrakciót fogunk fel, melyet 200, egyenként 20 ml-es frakció követ. A 6-194. frakciók közül 1:200 hígításban minden negyedik frakciót tesztelésnek vetünk alá. Bioaktivitást a 18—178. frakciók mutatnak, a maximum a 62-82. frakciókban jelentkezik. A 42-102-es frakciókat egyesítjük és 640 ml ionmentes víz hozzáadásával 1920 ml oldatot kapunk. Az egyesített hígított oldatot, amely Dowex 50 x 8 oszlopra felvitt oldat bioaktivitásának 63%-át tartalmazza, líofilizáljuk. A liofilizált szilárd anyagot 0,1 M 2,6-lutidin-acetátban oldjuk fel (pH = 7). A 25 ml oldatot 5x112 cm Bio—Gel P—2 oszlopra (200—400 mesh) visszük fel, az oldatot előzőleg 0,1 M pufferral egyensúlyba hoztuk. A gélt ugyanezzel a pufferral hívjuk elő 10 ml/min sebességgel. A kiáramló folyadékot Mecco-matic regisztráló differenciális refraktométerrel követjük nyomon. Az előhívást addig folytatjuk, ameddig 125, egyenként 20 ml-es frakciót össze nem gyűjtünk. A 70-89. frakciók mindegyikét 1 :300 hígításban teszteljük. A 72—81. frakciók a bioaktívak, a bioaktivitás a 77. frakcióban éri el a maximumot. A 75—79. frakciókat liofilizáljuk, és 100,5 mg 8320 egység/mg aktivitású antibiotikumot kapunk. A 100,5 mg súlyú liofilizált szilárd anyagot 4 ml pH = 7 értékű 0,01 M kálium-foszfát pufferben vesszük fel. Ez az oldat 692 hidroxil-amin-kioltási egységet tartalmaz. Az oldatot 1,7 cm átmérőjű 90 ml előzetesen mosott XAD—2 gyantával töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot használat előtt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
