175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
27 175265 28 4082 liter fermentlét 75,6 cm-es présszűrő és max. 4 súly/térfogat% szűrési segédanyag felhasználásával leszűrjük. 46 g (etilén-dinitril)-tetraecetsav-nátriumsót adunk a szűrlethez. A szűrletet 6 °C-ra hűtjük, a pH-t 46±0,2 értékre állítjuk be és 6 °C-on tartjuk. A hideg szűrletet 480 Uter Dowex 50 x 2 Na* (20-50 mesh) gyantán 48 liter/min sebességgel adszorbeáltatjuk. Miután 1400 hter előfrakció átment az oszlopon, 18,9 litert fogunk fel, a pH-t 7,08-ra állítjuk be. 300 ml Dowex 1 x 2 (50—100 mesh) klorid ciklusú gyantával töltött 3,8 cm átmérőjű oszlopot állítunk elő és 5 °C-on 300 ml ionmentes vízzel mossuk. Négy Uter hideg Dowex 50 x 4-et eresztünk az oszlopon keresztül 30 ml/min sebességgel. Az oszlopot 350 ml 25 pM EDTA-val mossuk, majd 5 °C-on 900 ml 0,01 M trisz-/trisz(hidroximetil)-amino-metán/-HCl-t tartalmazó 5%-os nátrium-klorid oldattal eluáljuk pH -1 mellett 15 ml/min sebességgel. 75 ml-es frakciókat gyűjtünk össze és lemez-diffúziós módszenei vizsgáljuk Staphylococcus aureus 6538P alkalmazásával. Az összes felvitt bioaktivitás 47%-át tartalmazó 4-10. frakciókat hozzáadjuk a 3. példában leírt bioanalízis céljából félretett első XAD-2 összeöntött minta 42,5 ml-éhez. Ezeket az egyesített frakciókat vákuumban koncentráljuk és a kapott 100 ml-es oldat pH-ját sósav hozzáadásával 6,32-re állítjuk be. 450 ml XAD—2 gyantával töltött 3,8 cm átmérőjű oszlopot egymást követően négy oszlopnyi térfogatú 0,001 M EDTA-val, 1 N nátrium-hidroxiddal, ionmentes vízzel, 1 N sósavval, ionmentes vízzel, metanollal, acetonnal, ionmentes vízzel előmossuk, majd felhasználás előtt 2250 ml 25 pM EDTA-t tartalmazó 5%-os nátrium-klorid oldattal mossuk. A fenti koncentrátumot a XAD—2 oszlopra visszük fel, majd kétszer 5 ml ionmentes vizet viszünk fel. Az oszlopot 5 °C-on hívjuk elő ionmentes vízzel 10 ml/min sebességgel. Az első frakció 40 ml-t tartalmaz, majd ezután 75 ml-es frakciók következnek, melyeket lemez diffúziós vizsgálatnak vetünk alá. A XAD—2 oszlopra betáplált összes bioaktivitás 22%-át tartalmazó 9-15 frakciókat összeöntjük és vákuumban 56 ml térfogatra sűrítjük be. A 40 ml Dowex 1 x 4 klorid ciklusú 400 mesh (vízből való dekantálással határozzuk meg) gyantával töltött 21 cm x 1,7,cm méretű oszlopot használat előtt 240 ml 0,005 M ammónium-kloridot és 0,1 mM ammóniumhidroxidot tartalmazó 0,2 M nátrium-kloriddal mossuk 1 ml/perc sebességgel, majd azonos sebességgel 120 ml ionmentes vízzel mossuk. A XAD—2 koncentrátumot az oszlopon kétszer 2 ml-es ionmentes víz adag, majd kétszer 2 ml eluáló puffer követi. Az oszlopot 1 ml/perc sebességgel 5 C-on 0,005 M ammónium-kloridot és 0,01 mM ammónium-hidroxidot tartalmazó 0,07 M nátrium-kloriddal eluáljuk. 10 ml-es frakciókat fogunk fel és ezeket lemez diffúziós módszerrel elemezzük. A felvitt bioaktivitás 100%-át tartalmazó 544—647 ml eluált frakciókat összeöntjük és vákuumban 2,3 ml-re koncentráljuk. A koncentrátum 36,4 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmaz. 225 ml Bio—Gel P—2 (200—400 mesh, 1800 Dalton kizárási határ) gyantával töltött 2,2 x 62 cm méretű oszlopot használat előtt 225 ml 1 M nátrium-kloriddal, majd 100 ml iomentes vízzel mosunk. A Dowex 1 x 4 koncentrátumot felvisszük az oszlopra, majd ezt kétszer 2 ml ionmentes víz követi. Az oszlopot 5 °C-on ionmentes vízzel hívjuk elő 1 ml/perc sebességgel és 2 ml-es frakciókat fogunk fel, melyeket lemez-diffúziós elemzésnek vetünk alá. A 7,04 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban 2 ml-térfogatúra bepároljuk és így az N-acetil-tienamicin termék vizes oldatát kapjuk. Összeöntjük a 117-123 ml-es és a 130—139 ml-es frakciókat és így 13,7 hidroxilamin kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó N-acetil-tienamicin oldatot kapunk. 5. példa Tienamicin előállítása Egy Streptomyces cattleya NRRL 8057 törzs liofilizált tenyészetét tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitunk és tartalmát 50 ml steril A közeget tartalmazó bedugaszolt 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban szuszpendáljuk. Az A táptalaj összetétele a következő: A táptalaj élesztő-autolízis termék (Ardaminex) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-puffer 2,0 ml magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz 1000 ml pH: nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be. xArdamine: Yeast Products Corporation Foszfát-puffer oldat kálium-dihidrogén-foszfát 91,0 g dinátrium-hidrogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml A beoltott tenyészetet tartalmazó lombikot 28 C-on 220 percenkénti fordulatszámú (5,08 cm löket) rázóberendezésben 48 óráig rázatjuk. A 48 óra múlva kapott fermentléből 40 ml-t aszeptikusán eltávolítunk és 40 ml steril 20 térfogat%-os glicerinnel összekeverjük. A kapott elegy 2 ml-ét steril 1,772 g-os ampullákba pipettázzuk, megfagyasztjuk és cseppfolyós nitrogénfagyasztó gőzfázisában tároljuk. 50 ml A táptalajt tartalmazó 250 ml-es bedugaszolt Erlenmeyer-lombikot beoltunk az ampullák megfagyott tartalmával. Ezt a beoltott tenyészetet tartalmazó lombikot 28 °C-on 24 óra hosszat rázzuk 160 percenkénti fordulatszámú rázógépben. A beoltott tenyészetet tartalmazó lombikból 10 ml-es adagokkal beoltunk 500 ml A-táptalajt tartalmazó 2 literes Erlenmeyer lombikokat. A beoltott tenyészetet tartalmazó lombikokat 160 percen-5 10 IS 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
