175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
23 175265 24 óra PH ATCC 6633 0,945 cm lemez (mm) 0 6,9 0 24 6,3 0 36 6,0 0 48 5,9 0 60 6,0 23 72 5,9-84 6,0 21 96 6,2-108 6,5 35 120 6,6 36 132 6,7 41 138 6,7 39 4082 liter fermentlét 760 cm-es présszűrő és 4 súly/térfogat% szűrési segédanyag felhasználásával szűrünk. A szűrlethez 46 g (etilén-dinitril)-tetraecetsavnátríumsót adunk. A szűrletet 6 °C-ra lehűtjük, a pH-t 4,5 ± 0,2 értékre állítjuk be, és a szűrletet 6 °C-on tartjuk. A hideg szűrletet 480 liter Dowex 50x4 Na+ 20—50 mesh gyantán adszorbeáltatjuk 48 iiter/min sebességgel. Miután egy 1400 literes előfrakciót áteresztünk, 18,9 litert szedünk, melynek pH értékét nátffum-hidroxiddal 7,08-ra állítjuk és 5 °C-on tároljuk. 300 ml Dowex 1x2, 50—100 mesh méretví kjorid ciklusú gyantával töltött 3,8 cm átmérőjű oszlopot készítünk és 5 °C-on 600 ml ionmentes vízzel mossuk. Négy liter hideg Dowex 50 x 4 folyadékot folyatunk az oszlopon keresztül 30 ml,'perc sebességgel. Az oszlopot 300 ml 25 pM EDTA-val mossuk. Az N-acetil-tienamicin antibiotikumot 5 °C-on 15 ml/min sebességgel eluáljuk 900 ml 5%-os nátriumklorid oldattal, amely 0,01 M kálium-foszfát pufferreJ készül (pH = 7) és 2 EDTA-t tartalmaz. Tizennégy, egyenként 75 ml-es frakciót gyűjtünk össze és megvizsgáljuk biológiai aktivitás szempontjából a lemez-diffúziós módszer segítségével. 525 ml 3—9 eluált frakciót egyesítünk és vákuumban koncentráljuk, a kapott folyadék 115 ml. A maradék a Dowex 1 x 2 klorid oszlopra vitt összes bioaktiv anyag 65%-át tartalmazza. A Dowex 1 x 2 klorid oszlopon eluált koncentrátumot 5 °C-on 3,8 cm átmérőjű 450 ml előmosott XAD-2-vel töltött oszlopra visszük. A XAD-2-t oszloponként egymás után négy oszlopnyi térfogat: 1. 0,001 M EDTA-val, 2. IN nátrium-hidroxiddal, 3. ionmentes vízzel 4. IN sósavval, 5. ionmentes vízzel, 6. metanollal, 7. acetonnal, 8. ionmentes vízzel és használat előtt 25 /jM EDTA-t tartalmazó 2250 ml 5%-os nátrium-klorid oldattal mossuk. A mintát felvisszük az oszlopra, majd kétszer 25 ml vizet viszünk fel. Az oszlopot 5 C-on ionmentes vízzel 10 ml/perc sebességgel hívjuk elő. Az első frakció 400 ml-t tartalmaz és még 11 további 75 ml-es frakciót gyűjtünk össze. Az egyes frakciók pH-ját 6,9-7,13-ra állítjuk IN nátrium-hidroxid vagy IN sósav hozzáadásával. A 3-9. frakciókat, melyek a XAD-2 oszlopra felvitt összes bioaktív anyag 46%-át tartalmazzák, egyesítjük és összesen 490 ml oldatot kapunk. 45 ml mintát félreteszünk a bio-elemzéshez, melyet a standard lemez-diffüziós módszerrel végzünk Staphylococcus aureus ATCC 6538P törzs alkalmazásával. A maradék 445 ml-t vákuumban 50 ml-re besűrítjük. Az 50 ml XAD-2-eluátum koncentrátumot 5 °C-on 1,5 cm-es 40 ml előmosott Dowex 1 x4 klorid —400 ciklusban dolgozó gyantával töltött oszlopra visszük 5 °C-on 1 ml/min sebességgel. A vízből dekantált Dowex 1 x4 klorid ciklusú 400 mesh gyantát használat előtt 240 ml 0,005 ammónium-kloridot és 0,01 mM ammónium-hidroxidot tartalmazó 0,2 M nátrium-kloriddal 1 ml/min sebességgel oszlopon keresztül, majd azonos sebességgel 120 ml ionmentes vízzel mossuk. A mintát felvisszük az oszlopra, majd kétszer 5 ml ionmentes vizet viszünk fel. Az oszlopot 5 °C-on 0,92 ml/perc sebességgel 0,005 M ammónium-kloridot és 0,1 mM ammónium-hidroxidot tartalmazó 0,07 M nátrium-kloriddal 5 °C-on hívjuk elő. 8,6—9,3 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. 600—710ml-ig a kapott eluált frakciókat összegyűjtjük és összeöntjük és a Dowex 1 x 4 oszlopra felvitt összes bioaktív anyag 98%-át tartalmazó terméket kapunk. Ezt a terméket vákuumban 2 ml-nyire koncentráljuk. ' A Dowex^. 1 x 4 koncentrátumot 225 ml Bio-Gel P—2-veT (200—400 mesh 1800 Dalton kizárási limit-desztillált vízből történő dekantálással határozzuk meg) töltött 2(2 cm-es átmérőjű oszlopra visszük. : A Bio—GeL P-2 oszlopot használat előtt 225 ml 1M nátrium-klorid oldattal, majd 100 ml ionmentes vízzel mossuk. Az oszlopot 5 C-on ionmentes vízzel hívjuk elő 1 ml/min sebességgel és 2 ml-es frakciókat szedünk. A 104—128ml-ig kapott eluátumokból eredő frakciókat, amelyek az összes Bio—Gel P—2 oszlopra felvitt bioaktív anyag 83%-át tartalmazzák, összeöntjük és 1,58 ml-re koncentráljuk. 1,6 cm x 27 cm-es 50 ml XAD-2 oszlopot állítunk elő és az oszlopot 200 ml 1 mM EDTA-val, 1 N nátrium-hidroxiddal, ionmentes vízzel, 1 N sósavval, metanollal, acetonnal és ionmentes vízzel előmossuk. A 44,4 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó Bio-Gel P-2 koncentrátumot 5 °C-on XAD—2-oszlopra visszük, majd még két 2 ml-es adag ionmentes vizet viszünk fel az oszlopra, Az oszlopot 1 ml/perc sebességgel mossuk ionmentes vízzel, amíg a mosott anyag ultraibolya abszorpciós képessége 300 nm hullámhossznál 0,060-ra csökken. Az oszlopot 50%-os metanollal eluáljuk 1 ml/min sebességgel ionmentes vízben és 1 ml-es frakciókat szedünk. A 300nm-nél 0,1 -nél 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
