175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
21 175265 22 53 órás korban a fermentleveket összeöntjük és szűrjük, 590 ml szűrletet kapunk pH = 5,9 értéken. A szűrlet pH-ját 7-re állítjuk be és 5,9 mg etiléndinitril-tetraecetsavat (EDTA) adunk hozzá. A fenti szűrletből 580 ml-t pH = 7-érték mellett 5 130 ml Dowex 1 x 2 klorid ciklusú gyantán adszorbeáltatjuk és a kifolyó folyadékot 2 x 290 ml-es frakciókban gyűjtjük össze. Az adszorbeált anyagot 130 ml ionmentes vízzel mossuk. A mosott adszorbeátumot hideg helyiségben tároljuk egy éjjelen 10 keresztül, majd 5%-os nátrium-klorid oldattal eluáljuk és 6 x 50 ml frakciót fogunk fel. A kezdeti bioaktivitás visszanyerésének százalékos értékét a lemezdiffúziós módszerrel mutatjuk ki, lásd az alábbi táblázatot: 15 Frakció Vibrio percolans ATCC 8461 Staph. aureus ATCC 6538P 2Q Eluált árakciók 1^5. 26% 1% Az 1—5. nátrium-kloridos frakciók tartalmazzák az N-acetil-tienamicint. A 4-es frakciót lemez-diffúziós elemzésnek vetjük alá, l,27cm-es 100pl antibiotikum oldatot tartalmazó lemezeket használunk, kontrollként Staphylococcus aureus MB—2985 törzset alkalmazunk és 29 mm-es zónaméretet kapunk. Az MB—2985 törzset tartalmazó tenyészeteket az 1. példában leírt módon állítjuk elő. 25 30 3. példa 35 A Streptomyces cattleya NRRL 8057 törzs liofilizált tenyészetet tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitjuk és a tartalmát 0,8 ml steril Davis sóoldatot tartalmazó kémcsőbe helyezzük. A sóol- 40 dat összetétele a következő: Davis sóoldat nátrium-citrát dikálium-hidrogén-foszfát kálium-dihidrogén-foszfát ammónium-szulfát magnézium-szulfát-heptahidrát desztillált víz 0,5 g 45 7.0 g 3.0 g 1.0 g 0,1 g 1000 ml 50 Ezzel a szuszpenzióval az A táptalaj (plusz agar) 4 ferde tenyészetét beoltjuk. Az A táptalaj összetétele a következő: 55 A táptalaj éleszt ő-autolízis termék (Ardaminex) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-puffer 2,0 ml magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz 1000 ml pH: nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be. xArdamine: Yeast Products Corporation 60 65 Foszfát-puffer oldat kálium-dihidrogén-foszfát 91,0 g dinátrium-hidrogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml A ferde tenyészetekben 25,0 g/liter agart adunk hozzá. A beoltott ferde tenyészeteket 1 hétig inkubáljuk 28 °C-on, majd 4 °C-on tároljuk. 10 ml A táptalajt (agar nélkül) aszeptikusán az egyik ferde tenyészetbe visszük át, a spórákat és a légmicéliumokat szuszpenzióba kaparjuk és 1,2 ml szuszpenziót arra használunk, hogy három, 500 ml A táptalajt (agar nélkül) tartalmazó, 2 literes, inokulum tenyészet tartására szolgáló Erlenmeyer-lombikot beoltunk vele. Ezt a beoltott tenyészetet tartalmazó lombikot 28 °C-on 160 percenkénti fordulatszámú rázógéppel rázzuk (5,08 cm-es löket) 24 óráig, ennyi idő alatt a növekedés kielégítő. A beoltott tenyészeteket tartalmazó lombikok tartalmát összeöntjük és beoltunk vele egy 467 liter A táptalajt (agar nélkül) tartalmazó 756 literes rozsdamentes acél fermentort. Ezt a fermentort 28 °C-on 130 percenkénti fordulatszámú keverési sebességgel működtetjük 24 órán keresztül, a levegő áramlási sebessége 4,7 liter/sec. Szükség szerinti azonban 0,1%-ot meg nem haladó mennyiségű, Polyglycol 2000 (Dow Chemical Corporation/habzásgátlót használunk. A pH értékek a következők: Kor (óra) 0 24 pH 6,3 6,4 Ebből a beoltott tenyészetet tartalmazó fermentorból 454 literrel beoltunk egy 4,082 liter E táptalajt tartalmazó 5,670 literes rozsdamentes acél fermentort. Az E táptalaj összetétele a következő: E táptalaj keményítőcukor 25,0 g kukoricalekvár (nedves bázis) 15,0 g desztillációs maradék 10,0 g gyapotmag közeg (Pharmamedia) 5,0 g kobalt-klorid-hexahidrát 0,01 g kalcium-karbonát (pH beállítás után) 3,0 g Polyglycol 2000 0,25 térfogat% csap /íz 1000 ml pH: nátrium-hidroxiddal 7,3-ra állítjuk be. Ezt a tartályt 24 °C-on 70 fordulat/perc keverési sebességgel 25,51/sec levegőáramlási sebességgel 138 óra hosszat működtetjük. Kívánt esetben Polyglycol 2000 habzásgátló adalékot adunk hozzá, 0,1%-nál nem nagyobb mennyiségben. A baktérium-ellenes hatásra vonatkozóan teszteléseket folytatunk és az eredményeket a következő táblázat tartalmazza: 11
