175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
17 175264 18 A foszfátpuffer-oldat összetétele: kálium-dihidrogénfoszfát 91,0 g dinátrium-hidrogénfoszfát 95,0 g desztillált víz ad 1000 ml Az „A” táptalajhoz 25,0 g/liter agart adunk. A beoltott ferde tenyészeteket egy hétig 28 °C-on inkubáljuk, majd 4 °C-on tároljuk. Inkubálás ideje, óra: 0 12 24 30 pH: 6,4 6,4 6,3 756 liter űrtartalmú, rozsdamentes acél fermen- 35 torba 467 liter „E” táptalajt töltünk, és a táptalajt 43 liter, az előző lépésben előállított oltó tenyészettel oltjuk be. Az „E” táptalaj összetétele: 25,0 g 15,0 g keményítőcukor kukoricalekvár (nedves anyag, szárazanyag-tartalom 52%) oldható cefre (gyártja a Brown Forman Distillers Company, Louisville, Kentucky) 10,0 g gyapotmagliszt (Pharmamedia) 5,0 g kobaltklorid-hexahidrát 0,01 g kalciumkarbonát (pH—állítás után bemérve) 3,0 g Pölyglycol 2000 0,25% csapvíz 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 7,3 értékre lúgosítva) 40 4 S 50 55 10 A fenti módon kapott ferde tenyészetek egyiké hez aszeptikus körülmények között 10 ml „A” táptalajt adunk, a spórákat és a légmicéliumot lekaparjuk az agarlemez felületéről, majd 3,3 ml, így kapott szuszpenzióval egy 2 literes Erlenmeyer- 15 -lombikba töltött, 500 ml térfogatú „A” táptalajt oltunk be. A lombikot 48 órán át 28 SC-on, rázógépen (fordulatszám: 160/perc, lökethossz: 5,08 cm) inkubáljuk. 190 liter űrtartalmú, rozsdamentes acél fermen- 20 torba 160 liter „A” táptalajt mérünk be, és a táptalajt a fenti módon előállított oltótenyészettel oltjuk be. A tenyészetet 24 órán át 28 °C-on, 150 fordulat/perc sebességgel keverjük és 0,09 m3 /perc sebességgel levegőztetjük. Szükség esetén a rend- 25 szerhez habzásgátlóként legföljebb 0,1% mennyiségű Polyglycol 2000-t (a Dow Chemical Co. gyártmánya) adunk. A rendszer pH-ja időben a következőképpen változik: Fermentáció ideje, óra PH Gátló zóna átmérője, mm Dextróz mg/ ml 0 6,8-... 22 ' 12 6,6-21,3 24 6,2-16,5 36 5,8 25 12,1 48 5,7 25 7,8 60 5,8 21,5 4,3 72 6,1 25 2,5 84 6,6 33 1,6 96 6,7 41,5 1,0 108 6,5 45 1,0 120 6,5 45 0,5 A fermentációt 24 °C-on, 95 fordulat/perc sebességű keverés és 0,28 m*/perc sebességű levegőztetés közben végezzük. A rendszerhez szükség esetén további mennyiségű habzásgátíót (Polyglycol 2Ó00) adhatunk, a hab zásgátló mennyisége azonban nem 60 haladhatja meg a rendszer össztömegére vonatkoztatott 0,1%-ot. A fermentléből időről-időre mintát veszünk, és a mintát biológiai elemzésnek vetjük alá. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük- 65 400 liter teljes fermentlevet szűrőprésen, szűrén segédanyag felhasználásával szűrünk, és a szűrlethez 1,2 g etiléndinitrilo-tetraecetsav-nátriumsót adunk. A szűrletet 6 °C-ra hűtjük, pH = 4,0 ± 0,2 értékre savanyítjuk, és 6 °C-on tartjuk. A hideg szűrletet 4 liter/perc sebességgel egy 38 liter Dowex 50 x 4 ioncserélő gyantával (nátrium-forma, szemcseméret: 20—50 mesh) töltött oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot 40 liter ionmentes vízzel mossuk, majd 2%-os, vizes piridin-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 19 literes frakciókba gyűjtjük. Három frakciót fogunk fel, és a frakciókat biológiailag elemezzük. Az elemzési adatok szerint a 2. és 3. frakció a fermentlé eredeti aktivitásának 22%-át tartalmazza. E frakciókat egyesítjük, 3,8 liter végtérfogatra bepároljuk, és a koncentrátumot pH = 7 értékre semlegesítjük. A koncentrátumot 200 né/perc sebességgel egy 2,5 liter Dowex 1 x 2 ioncserélő gyantával (klorid-forma, szemcseméret: 50—100 mesh) töltött oszlopon bocsátjuk át, és a gyantaoszlopot 200 ml/perc sebességgel ionmentes vízzel eluáljuk. 10, egyenként 1 literes eluátumfrakciót fogunk fel, és a frakciók pH-ját szükség esetén 7,0-ra állítjuk. A biológiai elemzések adatai szerint az 5—8. frakció aktivitása a kiindulási anyag aktivitásának 75%-át teszi ki. Ezeket a frakciókat egyesítjük, és 0,45 mikron pórusátmérőjű Millipore szűrőn szűrjük. A szűrletet 3 literes részletét fagyasztva szárítjuk. 16,6 g, 70 egység/mg aktivitású szilárd anyagot kapunk. A kapott szilárd anyag 4 g-os részletét 50 ml 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát pufferoldatban (pH = 6,3) oldjuk. Az oldat pH-ját ecetsav hozzáadásával ismét 6,3-ra állítjuk, majd az oldatot Dowex 50 x 8 ioncserélő gyantával töltött oszlopon
