175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
19 175264 20 bocsátjuk át. Az oszlopot a következőképpen készítjük elő: 2,5 liter Dowex 50 x 8 ioncserélő gyantát (hidrogén-formájú anyag, szemcseméret: 200—400 mesh) 2,6-lutidin-formájúvá alakítunk. A gyantát ötszörös térfogatú, 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát pufferoldattal (pH = 6,3) egyensúlyba hozzuk. A gyantát 5x114 cm méretű oszlopba töltjük. Az oszlopot 0,1 mólos pufferoldattal 14 ml/perc sebességgel eluáljuk. Az eluátum-áramot Mecco-matic regisztráló differenciál-refraktométerrel (gyártja az Engineering and Equipment Company, Hapboro, Pennsylvania)) vizsgáljuk. 220, egyenként 20 ml-es eluátum-frakciót fogunk fel, és a 44-142. frakciót 1 : 50 hígításban biológiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzés szerint a biológiailag aktív anyagot a 78—136. frakció tartalmazza, a koncentráció-maximum a 92—94. frakcióban jelentkezik. A 82-116. frakciót egyesítjük, a kapott 700 ml térfogatú oldatot két egyenlő részletre osztjuk, és az oldatrészleteket fagyasztva szárítjuk. Az egyik oldatrészletből elkülönített szilárd anyagot 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát pufferoldatban (pH = 7,0) oldjuk, és a 27 ml térfogatú oldatot a fenti pufferoldattal egyensúlyba hozott, 200-400 mesh szemcseméretű Bio—Gel P—2 géllel töltött, 5 x 108 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. A gélt a fenti összetételű pufferoldattal 10 ml/perc sebességgel eluáljuk. Az eluátum-áramot Mecco-matic regisztráló differenciál-refraktométerrel vizsgáljuk, összesen 105, egyenként 20 ml térfogatú eluátumfrakciót fogunk fel, és az 51—90. frakciót 1 :50 hígításban biológiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzés szerint a biológiailag aktív anyagot a 67-75. frakció tartalmazza, a maximális koncentráció a 70—71. frakcióban észlelhető. A 68-75. frakciót egyesítjük. Az így kapott 162 ml térfogatú oldat 145 ml-es részletéhez 3 ml 0,36 mólos nátriumfoszfát-pufferoldatot (pH = 7,0) adunk, és az oldatot 9 ml végtérfogatra bepároljuk. A koncentrátumot, amely a biológiailag aktív anyag 78%-át tartalmazza, fagyasztva szárítjuk. 185 mg szilárd anyagot kapunk. A fennmaradt 17 ml térfogatú oldatrészletet fagyasztva szárítjuk. 1,9 mg szilárd anyagot kapunk, amelynek aktivitása 1050 egység/mg. 5. példa Streptomyces cattleya NRRL 8057 liofilizált tenyészetét tartalmazó, leforrasztott ampullát aszeptikus körülmények között felnyitunk, és az ampulla tartalmát 0,8 ml steril Davis-sókompozicióban (0,5 g nátriumcitrát, 7,0 g dikálium-hidrogénfoszfát, 3,0 g kálium-dihidrogénfoszfát, 1,0 g ammóniumszulfát, 0,1 g magnéziumszulfát heptahidrát, desztillált víz ad 1000 ml) szuszpendáljuk. Az így kapott szuszpenzió 0,2 ml-es részleteivel egy-egy, alábbi összetételű agaros közeget („A” táptalaj + agar) oltunk be: Az „A” táptalaj összetétele: Ardamine (élesztő-autolizátum, a Yeast Products Co. gyártmánya) 10,0 g foszfátpuffer-oldat 2,0 ml glükóz 10,0 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz ad 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 6,5-re semlegesítve) A foszfátpuffer-oldat összetétele: kálium-dihidrogénfoszfát 91,0 g dinátrium-hidrogénfoszfát 95,0 g desztillált víz ad 1000 ml Az „A” táptalajhoz 25,0 g/liter agart adunk. A beoltott ferde tenyészeteket egy hétig 28 °C-on inkubáljuk, majd 4 °C-on tároljuk. A fenti módon kapott ferde tenyészetek egyikéhez aszeptikus körülmények között 10 ml „A” táptalajt adunk, a spórákat és a légmicéliumot lekaparjuk az agarlemez felületéről, majd 3,3 ml, így kapott szuszpenzióval egy 2 literes Erlenmeyer-lombikba töltött, 500 ml térfogatú „A” táptalajt oltunk be. A lombikot 48 órán át 28 4C-on, rázógépen (fordulatszám: 160/perc, lökethossz: 5,08 cm) inkubáljuk. 190 liter űrtartalmú, rozsdamentes acél fermentorba 160 liter „A” táptalajt mérünk be, és a táptalajt a fenti módon előállított oltótenyészettel oltjuk be. A tenyészetet 24 órán át 28 °C-on, 150 fordulat/perc sebességgel keverjük és 0,09 m3 /perc sebességgel levegőztetjük. Szükség esetén a rendszerhez habzásgátlóként legföljebb 0,1% mennyiségű Polyglycol 2000-t (a Dow Chemical Co. gyártmánya) adunk. A rendszer pH-ja időben a következőképpen változik: Inkubálás ideje, óra: 0 12 24 pH: 6,3 6,6 5,6 756 liter űrtartalmú, rozsdamentes acél fermentorba 467 liter „E” táptalajt töltünk, és a táptalajt 35 liter, az előző lépésben előállított oltótenyészettel oltjuk be. Az „E” táptalaj összetétele: keményítőcukor 25,0 g kukoricalekvár (nedves anyag, szárazanyag-tartalom: 52%) 15,0 g oldható cefre (gyártja a Brown Forman Distillers Company, Louisville, Kentucky) 10,0 g gyapotmagliszt (Pharmamedia) 5,0 g kobaltklorid hexahidrát 0,01 g kalciumkarbonát (pH-állítás után bemérve) 3,0 g Pblyglycol 2000 0,25 g csapvíz 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 7,3 értékre lúgosítva) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
