175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
11 175264 12 koncentrációjú cefalotin-oldatokat használtunk fel. Egy aktivitási egység az lug/ml koncentrációjú cefalotin-oldat aktivitásának felel meg (gátló zóna átmérője: 16—21 mm). 1. példa Streptomyces cattleya NRRL 8057 liofilizált tenyészetét tartalmazó, leforrasztott ampullát aszeptikus körülmények között felnyitunk, és az ampulla tartalmát 0,7 ml steril Davis-sókompozícióban (0,5 g nátriumcitrát, 7,0 g dikálium-hidrogénfoszfát, 3,0 g kálium-dihidrogénfoszfát, 1,0 g ammóniumszulfát, 0,1 g magnéziumszulfát-heptahidrát, desztillált víz ad 1000 ml) szuszpendáljuk. Az így kapott szuszpenzió 0,2 ml-es részletével az alábbi összetételű agaros közeget („A” táptalaj+agar) oltjuk be: Az „A” táptalaj összetétele: Ardamine (élesztő-autolizátum, a Yeast Products Co. gyártmánya) 10,0 g foszfátpuffer-oldat 2,0 ml glükóz 10,0 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz ad 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 6,5-re semlegesítve) A foszfátpuffer-oldat összetétele: kálium-dihidrogénfoszfát 91,0 g dinátrium-hidrogénfoszfát 95,0 g desztillált víz ad 1000 ml Az „A” táptalajhoz 25,0 g/liter agart adunk. A beoltott ferde tenyészeteket 8 napig 28 °C-on inkubáljuk, majd 4 °C-on tároljuk. 250 ml-es Erlenmeyer-lombükba 50 ml „A” táptalajt töltünk, és a táptalajt a fenti ferde tenyészetből elkülönített spórákkal és légmicéliumokkal oltjuk be. A lombikot bedugaszoljuk, és 2 napon át rázógépen (fordulatszám: 220/perc, lökethossz: 5,08 cm) 28 °C-on inkubáljuk. 15 db 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba 40—40 ml „B” táptalajt töltünk, majd a lombikok tartalmát 1—1 ml, a fenti lépésben kapott tenyészettel oltjuk be. A „B” táptalaj összetétele: kukoricaliszt 20,0 g oldható cefre (gyártja a Brown Forman Distillers Company, Louisville, Kentucky) 10,0 g szójaliszt 15,0 g nátriumcitrát 4,0 g kalciumklorid-dihidrát 0,5 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,1 g kobaltklorid-hexadekahidrát 0,01 g vas(II)-szulfát heptahidrát 0,01 g Polyglycol 2000 (a Dow Chemical Co. gyártmánya) 0,25 térf.% desztillált víz ad 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 6,5-re semlegesítve) A lombikokat 3 napon át 28 °C-on, rázógépen (fordulatszám: 220/perc, lökethossz: 5,08 cm) inkubáljuk. Ezalatt a fermentlevekből időről-időre mintát veszünk, a minta pH-ját szükség szerint módosítjuk, a mintát centrifugáljuk, majd a felülúszót 'a korábban ismertetett biológiai aktivitásvizsgálatnak vetjük alá. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük. Fermentálás ideje, óra 48 53 72 Gáltó zóna átmérője, mm 34/40 h 35/41 h 34 kezdeti pH 6,3 5,9 5,0 módosított pH 6,8 6,2 (Az aktivitási értékeknél feltüntetett „h” jelölés elmosódó sávkontúrt jelent.) 53 órás fermentáció után 13 lombik tartalmát egyesítjük. Az elegyből mintát veszünk, a mintát centrifugáljuk és biológiailag elemezzük. A fermentlé maradékát szűrjük, a szűrletet pH = 7-re semlegesítjük, majd 500 ml így kapott oldatot fagyasztva szárítunk. 10,7 g szilárd anyagot kapunk. Előtisztítás céljából a kapott szilárd anyag 1,5 g-os részletét 25 ml 1 : 99 arányú n-butanol/víz elegyben oldjuk, és a kapott oldatot (pH = 7) 5x118 cm méretű, előzetesen n-butanol és víz elegyével egyensúlyba hozott, 200—400 mesh szemcseméretű Bio—Gel P—2 géllel töltött oszlopra visszük fel. A géloszlopot 10 ml/perc sebességgel a fentivel azonos összetételű oldattal eluáljuk. 650 ml térfogatú előfrakciót elöntünk, majd az eluátumot 20 ml-es frakciókba gyűjtjük. Összesen 75 frakciót fogunk fel, és az egyes frakciókat biológiai aktivitásvizsgálatnak vetjük alá. A tienamicint a 34—40. frakció tartalmazza, a maximális tienamicin-koncentráció a 37. frakcióban észlelhető. A 37. frakció 10 ml-es részletét fagyasztva szárítjuk, és a kapott 2,0 mg szilárd anyagot 5 ml vízben oldjuk. Az így kapott oldatot biológiai vizsgálatnak vetjük alá, a vizsgálat során a rendszert éjszakán át 28 °C-on inkubáljuk. Az eredményeket az alábbiakban közöljük. Koncentráció, Mg/ml Gátló zóna átmérője, mm 80 30 40 25 20 21 10 17 Megjegyezzük, hogy ez az előtisztítás sok esetben elhagyható, és nem képezi a találmány lényegét. 2. példa Streptomyces cattleya NRRL 8057 liofilizált tenyészetét tartalmazó, leforrasztott ampullát aszeptikus körülmények között felnyitunk, és az am5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
