175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
13 175264 14 pulla tartalmát 0,8 ml steril Davis-sókompozícióban (0,5 g nátriumcitrát, 7,0 g dikálium-hidrogénfoszfát, 3,0g kálium-dihidrogénfoszfát, l,0g ammóniumszulfát, 0,1 g magnéziumszulfát-heptahidrát, desztillált víz ad 1000 ml) szuszpendáljuk. Az így kapott szuszpenzió 0,2 ml-es részleteivel egy-egy alábbi összetételű agaros közeget („A” táptalaj + agar) oltunk be: Az „A” táptalaj összetétele: Ardamine (élesztő-autolizátum, a Yeast Products Co. gyártmánya) 10,0 g foszfátpuffer-oldat 2,0 ml glükóz 10,0 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz ad 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH= 6,5-re semlegesítve) A foszfátpuffer-oldat összetétele: kálium-dihidrogénfoszfát 91,0 g dinátrium-hidrogénfoszfát 95,0 g desztillált víz ad 1000 ml Az „A” táptalajhoz 25,0 g/liter agart adunk. A beoltott ferde tenyészeteket 8 napig 28 °C-on inkubáljuk, majd 4 °C-on tároljuk. 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50 ml „A” táptalajt töltünk, és a táptalajt egy, a fenti módon kapott ferde tenyészetből elkülönített spórákkal és légmicéliumokkal oltjuk be. A lombikot bedugaszoljuk, és 2 napon át rázógépen (fordulatszám: 220/perc, lökethossz: 5,08 cm) 28 °C-on inkubáljuk. 15 ml 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba 40-40 ml „B” táptalajt töltünk, majd a lombikok tartalmát 1—1 ml, a fenti lépésben kapott tenyészettel oltjuk be. A „B” táptalaj összetétele: kukoricaliszt 20,0 g oldható cefre (gyártja a Brown Forman Distillers Company, Lousville, Kentucky) 10,0 g szójaliszt 15,0 g nátriumcitrát 4,0 g kalciumklorid-dihidrát 0,5 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,1 g kobaltklorid-hexadekahidrát 0,01 g vas(II)-szulfát-heptahidrát 0,01 g Polyglycol 2000 (a Dow Chemical Co. gyártmánya) 0,25 térf.% desztillált víz ad 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 6,5-re semlegesítve) A lombikokat 3 napon át 28 °C-on, rázógépen (fordulatszám: 220/perc, lökethossz: 5,08 cm) inkubáljuk. Ezalatt a fermentlevekből időről-időre mintát veszünk, a mintát centrifugáljuk, és a felülúszót a korábban ismertetett biológiai aktivitásvizsgálatnak vetjük alá. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük. Fermentálás ideje, óra 48 53 72 PH 6,7 6,4 5,5 Gátló zóna átmérője, mm 38 40 38 53 órás fermentáció után 13 lombik tartalmát egyesítjük és szüljük. A szűrlet 400 ml-es részletét híg, vizes sósavoldattal pH = 4,8 értékre savanyítjuk, és az oldatot 14ml/perc sebességgel 140 ml Dowex 50 x 2 gyantával (nátrium-forma) töltött oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot 200 ml ionmentes vízzel mossuk, majd 2%-os, vizes piridin-oldattal eluáljuk. 6 db, egyenként 70 ml térfogatú eluátumfrakciót fogunk fel, és a frakciókat pH = 7 értékre semlegesítjük. A szűrt fermentlét, és az egyes frakciókat biológiai elemzésnek vetjük alá. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük. Vizsgált anyag Hígítás Gátló zóna átmérője Szűrt fermentlé 1 : 4 33 mm Szűrt fermentlé 1 : 8 30 mm Szűrt fermentlé 1 : 16 27 mm Szűrt fermentlé 1 : 32 24 mm 1. eluátumfrakció 1 : 5 22,5 mm 2. eluátumfrakció 1 : : 5 36 mm 3. eluátumfrakció 1 : : 5 20 mm 4—6. eluátumfrakció 1 : : 5 0 mm Az elemzési adatok azt jelzik, hogy az eluátumfrakciók a kiindulási szűrt fermentlé antibiotikum-tartalmának 45%-át tartalmazzák. A 2. eluátumfrakciót fagyasztva szárítjuk. 117 mg szilárd anyagot kapunk. A kapott 117 mg szilárd anyagot 1,5 ml 1 :99 arányú n-butanol/víz elegyben oldjuk, és az oldatot Bio—Gel P—2 géllel töltött, 1,4x81,5 cm méretű oszlopra visszük fel. (A gélt előzetesen n-butanol/víz eleggyel egyensúlyba hozzuk.) A gélt 1 ml/perc sebességgel n-butanol/víz eleggyel eluáljuk, és az eluátumot 2 ml-es frakciókba gyűjtjük. A frakciók aktivitását 1 :20 hígításban vizsgáljuk. E vizsgálat szerint a tienamicin a 44-53. frakcióban dúsul fel. A 46—49. frakciót és az 50. frakció felét egyesítjük, és az elegy 1 ml-es mintáját ismét biológiai elemzésnek vetjük alá. A maradékot fagyasztva szárítjuk. 4,2 mg részlegesen tisztított antibiotikumot kapunk. 3. példa Streptomyces cattleya NRRL 8057 liofilizált tenyészetét tartalmazó, leforrasztott ampullát aszeptikus körülmények között felnyitunk, és az ampul-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6S 7
