175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
9 175264 10 dozó gyantákat, így Dowex 50 x 2 gyantát (gyártja a Dow Chemical Co., Midland, Michigan) használhatunk fel nátrium-formában. Az eljárásban felhasználható egyéb erős kationcserélő gyanták közül a következőket soroljuk fel: Dowex 50 x 4, Dowex 50 x 8 (gyártja a Dow Chemical Co., Midland, Michigan), Amberlite IR120 (gyártja a Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania) Duolite C25D (gyártja a Chemical Process Co., Redwood City, California), Permutit Q. (gyártja a Permutit Co., Birmingham, New Jersey), Ionac C-249 (gyártja az Ionac Chemical Co., Birmingham, New Jersey) és Amberlite 200 (gyártja a Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania). Az adszorbeált antibiotikumot szerves bázisok vizes oldataival könnyen leoldhatjuk a kationcserélő gyantáról. Szerves bázisként például piridint, a-, ß- vagy y-pikolint, 2,3-, 2,4- vagy 2,6-lutidint, 2,4,6-kollidint vagy 2—10 szénatomos (előnyösen 2-6 szénatomos) alkil-csoportokat tartalmazó alkilaminokat használhatunk fel. Bázisként előnyösen piridint alkalmazunk. A kapott eluátumot kívánt esetben további tisztítási műveleteknek vethetjük alá. E további tisztítási műveletekben például az eluátumot polisztirol-trimetilammóniumsó típusú anioncserélő gyantán kromatografálhatjuk, a gyanta ellenionként szokásos ionokat, például klorid- vagy acetát-ionokat tartalmazhat. Az így kapott eluátumot kívánt esetben további tisztítás céljából egy polisztirol-szulfonát-típusú kationcserélő gyantán, állandó pH-értéken, illékony vagy nem-illékony pufferanyag felhasználásával kromatografálhatjuk. Pufferként 6 és 8 közötti pH-értéket biztosító anyagokat használhatunk fel. A nem-illékony pufferek közül példaként a trisz(hidroximetü-aminometán-maleátot, a kakodilsavat, a kálium-dihidrogénfoszfátot és a nátrium-dihidrogénfoszfátot említjük meg. Nem illékony pufferként előnyösen nátrium-dihidrogénfoszfátot alkalmazunk. Illékony pufferként például N-etil-morfolint, a-, ß- vagy 7-pikolint vagy 2,3-, 2,4- vagy 2,6-lutidint használhatunk fel, különösen előnyösnek bizonyult a 2,6-lutidin. A kationcserélő gyantán végzett kromatografálás során kapott eluátumot megfelelő gyantán, például poliakrilamid-gélen vagy dextrángélen gélszűrésnek vetjük alá. Megfelelő mértékű frakcionálási és sómentesítést általában körülbelül 200-2000 molekulasúlyú, 50—100 mesh szemcseméretű gélek alkalmazásával érhetünk el. Az eljárásban 50-400 mesh szemcseméretű géleket is felhasználhatunk, az alkalmazható gélek szemcseméretének határait lényegében az oszlop méretei szabják meg. A gélszűréshez például Sephadex G—10 gélt (epiklórhidrinnel térhálósított dextrángél, gyártja a Pharmacia Company, Svédország) használhatunk fel, a gél nem tartalmazhat 700-nál nagyobb molekulasúlyú anyagokat. A gélszűréshez továbbá a Bio-Rad Laboratories cég (Richmond, California) „Bioi—Gel P—2” kereskedelmi nevű terméket (legföljebb 1800-as molekulasúlyú, metilén-bisz(akrilamid)-dal térhálósított poliakrilamid) is felhasználhatjuk. Gélszűrés előtt a tisztítandó, antibiotikum-tartalmú oldat pH-ját előnyösen közel semleges értékre állítjuk, majd az oldatot egyensúlyba hozzuk a géllel. Az antibiotikumot vízzel vagy más megfelelő eluálószerrel, például vizes rövidszénláncú alkanollal oldhatjuk le a gélről. Az eluátumot frakciókba gyűjtjük, és a biológiai vizsgálat alapján legaktívabbnak bizonyult frakciókat egyesítjük. A tisztított tienamicin elkülönítésének egy igen előnyös módszere szerint az antibiotikumtartalmú oldat (például a szűrt fermentlé) pH-ját 3 és 5 közötti értékre állítjuk, majd az oldatot nátrium-formájú, szulfonát-típusú, erősen savas kationcserélő gyantával (Dowex 50 x 2) töltött oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot megfelelő eluálószerrel, például 2%-os vizes piridin-oldattal eluáljuk. Az eluátumot frakciókba gyűjtjük (a frakciók térfogatát elsősorban az oszlop mérete határozza meg). A kapott eluátumot a következő műveleti lépésekkel tisztíthatjuk tovább: kromatografálás polisztirol-trimetilammóniumsó típusú anioncserélő gyantán (például klorid- vagy acetát-formájú Dowex 1x2 gyantán), kromatografálás polisztirol-szulfonát típusú kationcserélő gyantán (példává 2,6-lutidinium-formájú Dowex 50 gyantán, eluálószerként 2,6-lutidin-acetát pufferoldatot (pH = 6,3) alkalmazunk), gélszűrés (például Bio-Gel P-2 kereskedelmi nevű gyanta felhasználásával), egy- vagy többlépéses adszorpciós-elúciós művelet polimer adszorbens-gyantán (példáid XAD-2 polisztirol-gyaritán) víz vagy semleges pH-értékű hig, vizes foszfátpuffer-oldat felhasználásával. Az eluátumfrakciók aktivitását biológiai úton, Staphylococcus aureus ATCC 6538P vizsgálati mikroorganizmus felhasználásával határozzuk meg. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Amennyiben a példákban egyebet nem közlünk, az antibakteriális aktivitást a következőképpen vizsgáljuk: Staphylococcus aureus ATCC 6538P törzset éjszakán át 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó táptalajon tenyésztünk, majd a tenyészetet a tenyésztéshez felhasználttal azonos összetételű közeggel addig hígítjuk, amíg a szuszpenzió fényátbocsátóképessége 660 mju hullámhosszon vizsgálva eléri az 55%-ot. Az így kapott szuszpenziót 2,0 girier Difco élesztőkivonattal kiegészített, 47—48°C-os Difco tápagarhoz adjuk, 1 liter agárhoz 33,2 ml szuszpenziót adunk. Az így kapott szuszpenzió 5 ml-es részleteit Petri-csészékbe töltjük (átmérő: 85 mm), majd a Petri-csészéket felhasználásig 4 °C-on tároljuk. Az előkészített mikroorganizmust legföljebb 5 napig tárolhatjuk. Az antibiotikum tartalmú mintát foszfátpuffer-oldattal (pH,= 7) megfelelő koncentrációra hígítjuk. A hígított oldatba 1,27 cm átmérőjű szűrőpapír-korongot merítünk, majd a szűrőpapír-korongot az előzőek szerint előkészített Petri-csészére helyezzük. Egy Petri-csészére általában két szűrőpapír-korongot helyezünk átlós irányba. A rendszert éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk, majd lemérjük a gátló zónák átmérőit. A zónaátmérőből következtethetünk a vizsgált minta aktivitására, illetve tisztított összehasonlító anyag (például cefalotin) felhasználásával egység/ml értékekben kiszámíthatjuk a vizsgált minta antibiotikus aktivitását. A 4—7. példában közölt aktivitási értékek kiszámításakor összehasonlító anyagként 8, 4, 2, illetve lpgjml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
