175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
25 175264 26 Táblázat folytatása Fermentáció ideje, óra PH Gátló Gátló Dextróz zóna zóna mg/ml átmérője^1 * átmérője^ mm mm 120 6,3 41,5 37,0 132 5,8 37,5 144 5,9 43,0 37,5 A fermentlevet 76,2 cm átmérőjű szűrőprésen, 4 vegyes % szűrési segédanyag felhasználásával szűrjük, és a szűrlethez 12 g etiléndinitrilo-tetraecetsav-nátriumsót adunk. A szűrletet 6 °C-ra hűtjük, pH = 4 ,5±0,2 értékre savanyítjuk, és 6 °C-on tartjuk. A hideg szűrletet körülbelül 48 liter/perc sebességgel egy 480 liter Dowcx 50 x 4 gyantával (nátrium-forma, szemcseméret: 20-50 mesh) töltött oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot 480 liter ionmentes vízzel mossuk, majd 24 liter/perc sebességgel 2%-os, vizes piridin-oldattal eluáljuk. Három, 300 Uteres, 520 literes, illetve 240 Uteres eluátumfrakciót fogunk fel, és az eluátumfrakciókat pH = 7,0 értéken biológiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzés adatai szerint az egyes frakciók a teljes biológiailag aktív anyag 4%-át, 16%-át, iüetve 6%-át tartalmazzák. A 2. eluátumfrakciót 48 Uter végtérfogatra bepároljuk, és a koncentrátumot pH = 7 értékre semlegesítjük. A koncentrátumot pH = 7,3 értékre lúgosítjuk, majd 7,6 Uter/perc sebességgel egy Dowex 1 x 2 ioncserélő gyantával (klorid-forma, szemcseméret: 50—100 mesh) töltött oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot 7,6 Uter/perc sebességgel ionmentes vízzel eluáljuk. Az eluátumot 2 x 48, 1 x 70 és 1 x48 Uteres frakciókba fogjuk fel, és a frakciókat pH = 7 értékre semlegesítjük. A biológiai vizsgálatok eredményei alapján az antibiotikumot a 70 literes eluátumfrakció tartalmazza. Ezt a frakciót 18 Uter végtérfogatra bepároljuk, a koncentrátumot pH = 7,0 értékre semlegesítjük, majd 0,45 mikron pórusátmérőjű MilUpore szűrőn szűrjük. A szűrletet fagyasztva szárítjuk. 99 g, 310egység/mg aktivitású szilárd anyagot kapunk. A kapott szilárd anyag 10g-os részletét 125 ml 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát-pufferoldatban (pH = 6,3) oldjuk. Az oldat pH-ját ecetsavval 6,3-ra álUtjuk, majd az oldatot 2,6-lutidin-formájú, 200—400 mesh szemcseméretű előzetesen a fenti pufferoldattal egyensúlyba hozott Dowex 50 x 8 ioncserélő gyantával töltött, 7,6x142 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot 25 ml/perc sebességgel a fenti összetételű pufferoldattal eluáljuk. 3 Uter térfogatú előfrakciót elöntünk, majd az eluátumot 200, egyenként 20 ml térfogatú frakcióba gyűjtjük. A 36—192. frakciók közül minden negyediket 1 :200-as hígításban biológiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzési adatok szerint az antibiotikumot az 56—192. frakció tartalmazza, a koncentráció-maximum a 92—96. frakcióban jelentkezik. A 80-136. frakciót egyesítjük, és 590 ml ionmentes vízzel hígítjuk. A kapott, 1760 ml térfogatú oldatot, amely a Dowex 50x8 gyantaoszlopra felvitt anyag aktivitásának 70%-át kitevő antibiotikumot tartalmaz, fagyasztva szárítjuk. A kapott szilárd anyagot 27 ml 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát-pufferoldatban (pH = 7,0) oldjuk, és az oldatot a fenti összetételű pufferoldattal egyensúlyba hozott, 200—400 mesh szemcseméretű Bio—Gel P—2 géUel töltött, 5 x 112 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. A gélt 10 ml/perc sebességgel a fenti összetételű pufferoldattal eluáljuk. Az eluátum-áramot Mecco-matic regisztráló differenciál-refraktométerrel (gyártja az Engineering and Equipment Company, Hapboro, Pennsylvania) vizsgáljuk, összesen 105, egyenként 20 ml térfogatú eluátumfrakciót fogunk fel, és a 70-93. frakciót 1 :300 hígításban biológiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzés adatai szerint az antibiotikumot a 73—82. frakció tartalmazza, a koncentráció-maximum a 77-78. frakcióban jelentkezik. A 75—80. frakciót egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. 90 mg antibiotikumot kapunk, amelynek átlagos aktivitása 10 000 egység/mg. A kapott szilárd anyagot 4 ml 0,01 mólos káüumfoszfát-pufferoldatban (pH = 7) oldjuk. Az oldatot, amely 596 hidroxilaminnal kioltható optikai sűrűség-egységnek megfelelő mennyiségű antibiotikumot tartalmaz (ezt az elemzési módszert a példa végén ismertetjük), 5 °C-ra hűtjük, és 90 ml előmosott XAD—2 gyantával töltött, 1,7 cm átmérőjű oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot a következőképpen készítjük elő: a gyantát 5 térfogatrész 1 n vizes nátriumhidroxid-oldattal mossuk, ionmentes vízzel semlegesre mossuk, ezután 5 ml 1 n vizes sósavoldattal mossuk, ionmentes vízzel semlegesre mossuk, majd 5—5 lérfogatrész metanollal, acetonnal, 0,001 mólos etiléndiamin-tetraecetsav-tetranátriumsó-oldattal és desztillált vízzel mossuk, végül 180 ml 0,01 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7) 5 °C-on egyensúlyba hozzuk. Az oldószereket felhasználás előtt vákuum-kezeljük. A minta felvitele után az oszlopra 2 x 2 ml foszfátpuffer-oldatot viszünk fel, majd az oszlopot 5 °C-on 2 ml/perc sebességgel a fenti foszfátpuffer-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 4 ml-es frakciókba gyűjtjük. Az eluátum 100—253. ml-ét egyesítjük és forgó bepárlón, vákuumban, 10°C-nál alacsonyabb hőmérsékleten 6 ml végtérfogatra bepároljuk. A kapott oldatot, amely 436 hidroxilaminnal kioltható optikai sűrűség-egységnek megfelelő mennyiségű antibiotikumot tartalmaz, 90 ml, a fenti módon mosott és 5 °C-on desztillált vízzel egyensúlyba hozott XAD-2 gyantával (gyártja a Rohm and Haas Co.) töltött, 1,7 cm átmérőjű oszlopra visszük fel, majd az oszlopra 2 x 2 ml desztillált vizet viszünk fel. Az oszlopot 2 ml/perc sebességgel desztillált vízzel eluáljuk. Az eluátumot 4 ml-es frakciókba gyűjtjük. Az eluátum 100—151. ml-ét egyesítjük és forgó bepárlón 2,73 ml végtérfogatra bepároljuk. A kapott Koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 6,49 mg tienamicint kapunk. Az eluátum 152-345 ml-ét egyesítjük, forgó bepárlón 3,34 mi végtérfogatra bepá5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
