175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
27 175264 28 roljuk, és a koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. Ekkor 11,53 mg antibiotikumot kapunk. E frakciók összesen 369 hidroxilaminnal kioltható optikai sűrűség-egységnek megfelelő mennyiségű antibiotikumot tartalmaznak, ami az első XAD—2 oszlopra felvitt anyaggal összehasonlítva 3,1-szeres tisztítási faktornak felel meg. A termék számított aktivitása 31 000 egység/mg. A termék ultraibolya abszorpciós spektrumában (foszfátpuffer, pH = 7) 297 nm-nél lép fel maximum (eJ^ =253). Hidroxilaminnal kioltható abszorpcióképesség mérése: A tiszta tienamicin ultraibolya abszorpciós spektrumában 297 nm hullámhosszon észlelhető abszorpciós maximum. A tienamicin híg hidroxilamin-oldattal dezaktiválható, ami egyúttal az abszorpcióképesség megszűnését (azaz a maximum eltűnését) vonja maga után. Ezt a jelenséget a szennyezett minták antibiotikum-tartalmának meghatározására használhatjuk fel. A mérést a következőképpen végezzük: A szennyezett, antibiotikum-tartalmú mintából 0,01 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,0) 0,05 és 2,0 közötti A297-értékű oldatot készítünk. Az oldathoz lOmmól frissen készített, semleges hidroxilamint (NH2OH • HCl+NaOH, pH = 7) adunk, és a rendszert legalább 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután meghatározzuk a minta A29 7-értékét. A két A297-érték különbsége (a reagens beadagolásakor bekövetkező hígítás korrekcióba vétele után) adja a hidroxilaminnal kioltható abszorpcióképesség mértékét. Tiszta tienamicin-oldatok esetén ez az érték 94,5%. 7. példa A 6. példában ismertetett eljárás során, a Dowex 1 x 2 gyantaoszlopon végzett tisztítás után kapott 99 g fagyasztva szárított termék 10g-os mintáját 125 ml 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát pufferoldatban (pH = 6,3) oldjuk. Az oldatot ecetsavval pH =6,3 értékre savanyítjuk, majd a pufferoldattal előzetesen egyensúlyba hozott 2,6-lutidin-formájú Dowex 50x8 gyantával töltött, 7,6 x 142 cm méretű oszlopra visszük fel. Az oszlopot 35 ml/perc sebességgel a fenti összetételű pufferoldattal eluáljuk. 3,6 liter térfogatú előfrakciót elöntünk, majd az eluátumot összesen 200, egyenként 20 ml térfogatú frakcióba fogjuk fel. A 6-194. frakció közül minden negyediket 1 :200 hígításban biológiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzési adatok szerint az antibiotikumot a 18—178. frakció tartalmazza, koncentráció-maximum a 62—82. frakcióban észlelhető. A 42—102. frakciót egyesítjük, 640 ml ionmentes vízzel hígítjuk, majd a kapott, 1920 ml térfogatú oldatot, amely a kiindulási anyag aktivitásának 63%-át kitevő aktivitással rendelkezik, fagyasztva szárítjuk. A kapott szilárd anyagot 25 ml 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát pufferoldatban (pH = 7,0) oldjuk, és az oldatot a fenti pufferoldattal egyensúlyba hozott, 200-400 mesh szemcseméretű Bio—Gél P-2 géllel töltött, 5 x 112 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. A géloszlopot 10 ml/perc sebességgel a fenti pufferoldattal eluáljuk. Az eluátum-áramot Mecco-matic regisztráló differenciál-refraktométerrel (gyártja az Engineering and Equipment Company, Hapboro, Pennsylvania) vizsgáljuk, összesen 125, egyenként 20 ml térfogatú eluátumfrakciót fogunk fel, és a 70—89. frakciót 1 :300 hígításban biológiai vizsgálatnak vetjük alá. Az elemzési adatok szerint a biológiailag aktív anyagot r 72-81. frakció tartalmazza, a koncentráció-maximum a 77. frakciónál jelentkezik. A 75-79. frakciót egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. 100,5 mg, 8 320 egység/mg aktivitású antibiotikumot kapunk. A kapott szilárd anyagot 4 ml 0,01 mólos káliumfoszfát-pufferoldatban (pH = 7) oldjuk. Az oldatot, amely 692 hidroxilaminnal kioltható optikai sűrűség-egységnek me|felelő mennyiségű antibiotikumot tartalmaz, 5 C-ra hűtjük, és 90 ml előmosott XAD—2 gyantával töltött 1,7 cm átmérőjű oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot a következőképpen készítjük elő: a gyantát 5 térfogatrész 1 n vizes nátriumhidroxid-oldattal mossuk, ionmentes vízzel semlegesre mossuk, ezután 5 ml 1 n vizes sósavoldattal mossuk, ionmentes vízzel semlegesre mossuk, majd 5—5 térfogatrész metanollal, acetonnal, 0,001 mólos etiléndiamin-tetraecetsav-tetranátriumsó-oldattal és desztillált vízzel mossuk, végül 180 ml 0,01 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7) 5 °C-on egyensúlyba hozzuk. Az oldószereket felhasználás előtt vákuumban tisztítjuk. A minta felvitele után az oszlopra 2 x 2 ml foszfátpuffer-oldatot viszünk fel, majd az oszlopot 5 °C-on 2 ml/perc sebességgel a fenti foszfátpuffer-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 4 ml-es frakciókba gyűjtjük. Az eluátum 109—309. ml-ét egyesítjük, és az így kapott oldathoz a 6. példa szerint előállított, XAD-2 gyantán tisztított, 11,53 mg súlyú antibiotikumot adjuk (antibiotikum-tartalom: 186 hidroxilaminnal kioltható optikai sűrűség-egység). A kapott elegyet forgó bepárlón, vákuumban, 10°C-nál alacsonyabb hőmérsékleten 7 ml végtérfogatra bepároljuk. A kapott oldatot, amely 720, hidroxilaminnal kioltható optikai sűrűség-egységnek megfelelő mennyiségű antibiotikumot tartalmaz, 90 ml, a fenti módon mosott és 5 °C-on desztillált vízzel egyensúlyba hozott XAD-2 gyantával töltött, 1,7 cm átmérőjű oszlopra visszük fel, majd az oszlopra 2 x 2 ml desztillált vizet viszünk fel. Az oszlopot 2 ml/perc sebességgel desztillált vízzel eluáljuk. Az eluátumot 4 ml-es frakciókba gyűjtjük. Az eluátum 109—301. ml-ét egyesítjük és forgó bepárlón 10,3 ml végtérfogatra bepároljuk. A kapott koncentrátumot, amely 589 hidroxilaminnal kioltható optikai sűrűség-egységnek megfelelő mennyiségű antibiotikumot tartalmaz, fagyasztva szárítjuk. 23,6 mg antibiotikumot kapunk, számított aktivitás: 30 140 egység/mg. Az így kapott antibiotikum fehér, amorf, rostos szerkezetű szilárd anyag. Ha az antibiotikum mintáját üveg-kapillárisban 3 °C/perc sebességgel melegítjük, az anyag folyékony fázis képzése nélkül bomlást szenved. A bomlás fázisai a következők: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
