175255. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás az antimikotikus tulajdonságú mikoheptin előállítására, különösen az antibiotikum elkülönítésére
3 175255 4 Az ismert eljárással mindössze 3,9 g végterméket kapnak, amelynek az extinkciója 383 nm-en 600. Ennek a pentaéntől nem kielégítően megtisztított mikoheptinnek az összhozama így csupán 23%. Az ismert eljárások hátrányai úgy foglalhatók össze, hogy csekély a mikoheptin micéliumból történő extrakciójának mértéke, mivel a mikoheptin rosszul oldódik szerves oldószerekben, például kisszénatomszámű alkoholokban, emellett gyenge az elérhető termelés és a végtermék minősége. A találmány céljául tűztük ki a fent említett hátrányok kiküszöbölését. Ezzel összhangban a találmány szerinti eljárás feladata az, hogy az elkülönítés technológiájának gondos megváltoztatásával növeljük a mikoheptin micéliumból való extrakciójának hatásfokát, és javítsuk a kinyert mikoheptin minőségét. A találmány szerint úgy járunk el, hogy a Streptoverticillium mycoheptinicum Konyev-Csuganov 44B/1 törzs (amely a Leningrádi Antibiotikum Kutató Intézetben 1963. október 26-án LIA—0090 számon lett letétbe helyezve) vagy variánsa a Streptoverticillium mycoheptinicum 440 törzs) amely a Szovjetunió Össz-szövetségi Antibiotikum Kutató Intézetében 1973. július 3-án 1514 számon lett letétbe helyezve) micéliumából az antibiotikumot 10—15 súly% metilénkloridot és 1—10 súly% kalciumkloridot tartalmazó 65-80%-os vizes izopropanol-oldattal extraháljuk, az antibiotikumot vizzel kicsapjuk, a csapadékot vizes izopropanol-oldattal mossuk, majd dimetilformamidban oldjuk, az oldatból vízzel ismét kicsapjuk, 0,2—0,5 súly% nátriumhexametafoszfátot tartalmazó 20—50%-os vizes n-propanol-oldattal kezeljük, végül vízzel és acetonnal mossuk. A micéliumot előnyösen olyan 65-80%-os vizes izopropanol-oldattal extraháljuk, amely 2 súly% kalciumkloridot és 10 súly% metilénkloridot tartalmaz. Ugyancsak előnyösen, a mikoheptin tisztítása során 5%-os dimetilformamid-oldatot készítünk, amelyhez azonos térfogatú vizet adunk, és a kivált és leválasztott antibiotikumot 0,5 súly% nátriumhexametafoszfátot tartalmazó 40%-os vizes n-propanol-oldattal kezeljük. Az antimikotikus tulajdonságú mikoheptin antibiotikumot az alábbiak szerint különítjük el. A Streptoverticillium mycoheptinicum 44B/1 törzs vagy 440 variánsa micéliumát 10—15 súly% metilénkloridot és 1-10 súly% kalciumkloridot tartalmazó 65-80%-os vizes izopropanol-oldattal extraháljuk. Extrahálószerként célszerűen 10 súly% metilénkloridot és 2 súly% kalciumkloridot tartalmazó 65-80%-os vizes izopropanol-oldatot alkalmazunk. Az extrahálást 1—3 alkalommal megismételjük, annak érdekében, hogy a micéliumból az antibiotikumot teljes mértékben kinyerjük. Az alkalmazott extrakciók száma a micélium antibiotikum-tartalmától függ. Az extrakció meggyorsítására a hőmérsékletet legfeljebb 60 °C-ig emelhetjük. Az egyesített extraktumokat ezen a hőmérsékleten vákuumban bepároljuk, a maradékot lehűtjük, és a sűrítményből az antibiotikumot vizzel kicsapjuk. A csapadékot elkülönítjük, és az így kapott nyers antibiotikumot vizes izopropanol-oldattalmossuk, majd az antibiotikumpasztát elválasztjuk acetonnal mossuk, és vákuumban szárítjuk. A megszárított antibiotikumot dimetilformamidban oldjuk, és a szűrt oldatból a mikoheptint vízzel kicsapjuk. A kapott antibiotikumpasztát 0,2-0,5 súly% nátriumhexametafoszfátot tartalmazó 20—50%-os vizes n-propanol-oldattal mossuk. Célszerűen 0,5 súly% nátriumhexametafoszfátot tartalmazó '40%-os vizes n-propanol-oldatot alkalmazunk. Ezután az antibiotikumpasztát elválasztjuk, vízzel és acetonnal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A végtermék átlagos hozama, a micélium antibiotikum-tartalmára számítva, az aktivitás alapján 33%. A végtermék aktivitását mikrobiológiai agar-agar diffúziós módszerrel határozzuk meg [VFS42 —384—74], standard mikoheptinnel [VFS42-385—74] összehasonlítva. A találmány szerinti eljárás legfontosabb új jellemzői az alábbiak: 1. Az extrakcióhoz szelektív extrahálószert alkalmazunk, amely vizes izopropanolból, metilénkloridból és 1—10 súly% kalciumkloridból áll. 2. A szennyező anyagokat először izopropanollal kimossuk, majd az antibiotikumot dimetilformamid-oldatban oldjuk, és kicsapás után 0,2—0,5 súly% nátriumhexametafoszfátot tartalmazó 20—50%-os vizes n-propanollal mossuk. A találmány szerinti eljárásnál, az extrakciós, kicsapási és tisztítási technológia lényeges megváltoztatásával 50%-kal növekszik a mikoheptin micéliumból történő extrakciójának mértéke, és javul a végtermék minősége. A Streptoverticillium mycoheptinicum 44B/1 440 (NI 514) törzs tulajdonságai a következők: A törzs egyenes és kissé ívelt, egy és két sorban elrendezett spóratartókkal rendelkezik, a spórák sima burkú 0,8-1,0 x 1,2 -1,5/rm nagyságú pálcikaszerű alakzatok. 1 g/liter dikáliumhidrogénfoszfátot, 3 g/liter nátriumnitrátot, 0,5 g/liter káliumkloridot, 0,5 g/liter magnéziumszulfátot 0,015 g/liter vas(II)szulfátot, 20 g/liter keményítőt, 20 g/liter agar-agart és 1 liter vizet tartalmazó, 1,6 atm nyomáson 30 percig sterilizált, 6,8-7,0 közötti pH-értékű táptalajon 7—10 mm átmérőjű, ívelt kolóniákat képez, középen egy redővel. A légmicélium bársonyos, jól fejlett, rózsaszínű árnyalatú, a széle húsvörös, a szubsztrátmicélium barna, a táptalaj sárgásbarna. Keményítő- és ammóniatartalmú táptalajon kissé ívelt, csaknem sima, 6-11 mm átmérőjű kolóniákat képez, a létrejövő micélium színe hússzínű rózsaszíntől sötét hússzínig változik, a szubsztrátmicélium sötét gesztenyebama, a táptalaj barna. Glicerin- és aszparagin-tartalmú táptalajon lapos, sugarasan redőzött, 8—10 mm átmérőjű kolóniákat képez, amelyek közepén bemélyedés található, a légmicélium a kolónia szélén képződik, füstszínű, a szubsztrátmicélium vörösesbarna a táptalaj vörösesbarna. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen ismertetjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6$ 2
