175208. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens trigliceridek meghatározására
175208 4 mat és a reakcióhőmérsékletet még tovább sikerül csökkentenünk. A találmány szerint az olyan RCKCH2 0)n H általános képletű vegyületek előnyösek, ahol n 9-15-ig terjedő számot jelent. Különösen előnyösek azok, ahol n = 12. 5 Az RO(CH2CH2 0)n H általános képletű vegyületeket célszerűen a pufferoldat térfogatához képestf 0,005 - 0,2 súly %-nyi mennyiségben alkalmazzuk. Különösen előnyös a 0,01 - 0,03 súly% közötti mennyiség. 10 Az eljárás körülményeire és egyebekre vonatkozólag érvényesek a 2 229 849 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban előírtak. Szérumalbumin, különösen marha-szérumalbumin hozzáadása előnyös, ha a minta nem tartalmaz proteinből 15 asszociált trigliceridet. A 2 229 849 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírástól eltérően a találmány szerinti eljárásnál foszfátpuffer is megfelel, sőt előnyös. Különösen alkalmasnak bizonyult a 0,02 —0,1 mólos, 6,5 20 - 8,0 pH-jú foszfátpuffer. A találmány szerinti eljárás foganatosítására alkalmas reagenst, amely lipázt, különösen Rhizopus arrhizusból származó lipázt, karboxilészterázt, 10-15 szénatomos alkil-csoporttal rendelkező alkálifém- 25 vagy alkáli-földfém-alkil-szulfátot, puffert és glicerin kimutatására alkalmas rendszert tartalmaz, az jellemzi, hogy ezenkívül még egy R0(CH2CH20)nH általános képletű vegyületet is tartalmaz, ahol R 30 jelentése 14-20 szénatomos alkil- vagy alkenilcsoport, és n jelentése 7-20-ig terjedő szám. Mint a 2 229 894 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás szerinti megoldásnál elvileg itt is mindegyid glicerin kimutatására alkalmas rendszer alkalmazható, azonban olyan kimutatásra szolgáló rendszer előnyös, amely NADH-ból, ATP-ből, PEP-ből, LDH-ból, PK-ból. GK-ból valamint magnéziunuonokból cs pufferból áll. Az előnyös reagenskombinációk közül az egyik különösen alkalmas reagens a következőkből áll: 0,1-10.0 mg/ml lipáz (Rhizopus arrhizusból), 45 0,01-20.0 mg/ml karboxilészteráz (mikroorganizmusokból), 0.01-0,2 mg/ml nátrium-dodecil-szulfát, 0,015-0,3 mg/ml cetil-sztearil- poliglikol-éter (12 mól etilén-oxiddal), 50 1- 20 mmól redukált alakú nikotinamid-adenindinukleotid (NADH), 10-100 mmól adenozin-trifoszfát (ATP), 2- 20 mmól foszfo-enol-piroszőlősav (PÉP). 0,5-5 mg/ml tejsavdehidrogenáz (LDH), 55 0.2-5 mg/ml foszfo-enol-kináz (PK), 0,05-10 mg glicerin-kináz (GK), 0,1-2,0 mg/ml szérumalbumin, 3- 30 mmól magnéziumion és 0,012-0.3 mólos. 6-9 pH-jű pufferoldat. 60 A találmány szerinti eljárás a meghatározás pontosságát tovább növeli. Ezenkívül az eljárás időtartamát 10 percre csökkenthetjük, és emellett szobahőmérsékleten dolgozhatunk. A következő példák bővebben szemléltetik a 65 találmányt: 3 1. példa: A találmány szerinti reagenst a következőkből állítjuk össze: 1. Pufferoldat: 0,05 mólos 7,0 pH-jú nátrium-foszfát puffer, amely 4 mmól magnézium-szulfátot, 0,01 % nátrium-dadecil-szulfátot, 0,015 % cetil-sztearil-poliglikol- étert (12 mól etilén-oxiddal) tartalmaz. 2. Koenzimkeverék: 10 mmól NADH, 22 mmól ATP-nátriumsó, 18 mmól PEP-ciklohexil-ammóniumsó. 3. Enzimkeverék: 400 U/ml lipáz (Rhizopus arrhizus), 50 U/ml karboxilészteráz (mikroorganizmusokból), 50 U/ml PK (nyúlizomból), 300 U/ml LDH (sertésszívből), ammónium-szulfát oldatban szuszpendálva. 4. 150 U/ml glicerin-kináz, ammónium-szulfát oldatban szuszpendálva. Az 1-4. keverékek +4°C-on legalább 1 évig tárolhatók. A 2. keverék feloldás után ezen a hőmérsékleten körülbelül 2 hétig tárolható. Az 1-3. reagensekből reakciókeveréket készítünk, amely lehűtve körülbelül 2 napig tárolható. A 2. keveréket először desztillált vizbeN oldjuk. A kész reakciókeverékhez az 1. és 2. oldatokat és a 3. szuszpenziót 50 : 1,0 : 1,0 térfogatarányban elegyítjük. A meghatározást vakpróbával vagy anélkül végezzük. A meghatározás kivitelezése vakpróba figyelembevételével: Az 1. 2. és 3. oldatokból készített reakciókeverék 5,0 ml-ét összekeverjük 0,1 ml szérummal. Ebből az oldatból kiveszünk 2,0 — 2,5 ml-t, és összekeverjük 0,01 ml 4. szuszpenzióval (minta); a maradék a vakpróba. A két oldatot körülbelül 10 percig hagyjuk állni 20-25 °C-on, és mérjük a minta extinkcióját a vakpróbával szemben. A mért értéket használjuk számitáshoz. Meghatározás vak próba nélkül: Az 1. 2. és 3. oldatokból készített reakciókeverék 2,5 ml-ét összekeverjük 0,05 ml szérummal, körülbelül 10 percig hagyjuk állni 20-25° C-on, és utána megmérjük az oldat extenkcióját. Ezután 0,01 ml 4. szuszpenziót keverünk hozzá, és 10 perc múlva ismét mérjük az extinkciót. A két mérés különbségét használjuk számításhoz. A mérést fotométeren 365, 340 vagy 334 nm-nél végezzük. A számítást az egyes mérési hullámhosszaknál az extinkciókülönbség 15,5 (365 nm), 8,23 (340 nm) illetve 8,53 (334 nm) értékkel történő szorzásával végezzük, mikoris az eredményt mmól triglicerid/liter minta koncentrációban kapjuk meg. A meghatározás ismétlése különböző mennyiségű trigliceridet tartlamazó szérumokkal egyenest eredményez. A meredekség (arányossági tényező) - 0,997. 2
