175158. lajstromszámú szabadalom • Eljárás naftacénszármazékok előállítására
37 175158 38 A steril A folyékony táptalajt tartalmazó lombikokat 2—2 lombikból álló 6 csoportba osztjuk. Az A, csoportbeli lombikokhoz nem adunk további adalékot. A többi 5 csoport lombikjaiba a következő adalékot adjuk: A2 csoport : 1 ml szulfanilamid-oldat (0,2 g/liter), A3 csoport : 2 ml szulfanilamid-oldat (0,4 g/liter), A4 csoport : 3 ml szulfanilamid-oldat (0,6 g/liter), A5 csoport : 4 ml szulfanilamid-oldat (0,8 g/liter), A6 csoport : 1 ml szulfanilamid-oldat (0,2 g/líter). Az Ai csoportbeli lombikokat, és azokat, amelyekbe szulfanilamidot adtunk, Streptomyces coeruleorubidus DS 7 126 (NRRL 8098) 72 órás tenyészetének lombikonként 2,5—2,5 ml mennyiségével beoltjuk. A tenyészeteket 26°-on, rázóasztalon percenként 220 fordulattal való keverés közben inkubáljuk. Az A6 csoportba tartozó lombikokba 48 óra és 72 óra elteltével 2-2 újabb szulfanilamid-oldatot adunk, így ezekben a végső szulfanilamid-koncentráció 0,6 g/liter. Mindegyik hozzáadás után a lombikok inkubálását ugyanilyen keverési és hőmérsékleti körülmények között folytatjuk. Miután a fenti körülmények között a lombikokat 7 napig inkubáltuk, mindegyik csoportból az egyik lombik tartalmát a 32 999 RP jelű vegyület mennyiségi meghatározására használjuk fel. A meghatározást úgy hajtjuk végre, hogy mindegyik lombikba 4 g oxálsavat adunk (a fermentlé pH-ja 1.5- re változik), és 50 ml vízmentes etanolt öntünk hozzá. A keveréket tartalmazó lombikokat légmentesen lezárjuk, és 1 óra hosszat rázóasztalon percenként 220 fordulattal keverjük. Ezután a keveréket szűrőpapíron szűréssel elválasztjuk, és a szüredéket 50 -on, csökkentett nyomáson eredeti térfogatának felére, azaz 50 ml-re bepároljuk. A bepárlási maradék pH-ját 5 n nátriumkarbonát-oldattal 4.5- re állítjuk be, majd fokozatosan hozzáadunk 50 ml 80 : 20 térfogatarányú metilénklorid-n-butanol elegyet és 25 ml 9,0 pH-jú 0,5 mólos borát-pufferoldatot. Választótölcsérben való rázás után a színes szerves fázist elválasztjuk, és a vizes anyalúgokat 50 ml ugyanilyen oldószerkeverékkel extrahálva a kezelést megismételjük. A szerves fázisokat egyesítjük, és vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk. Végül a szerves fázis térfogatát ugyanilyen oldószerkeverékkel 100 ml-re egészítjük ki. A 32 999 RP jelű vegyület kitermelésének meghatározására ezeket a kivonatokat vékonyrétegen kromatografáljuk. 1 1. A termék minőségi meghatározására kovasavgél vékonyréteglemezekre (Merck 60 minőségű, fluoreszkáló indukátor nélküli üveglapon) 100/aliter kivonatot és 2,5—10/ag összehasonlításra szolgáló tiszta 32 999 RP mintát viszünk fel. A lemezeket 80 : 20 :10 : 4 térfogatarányú metilénklorid-etanol-ecetsav-víz keverékkel fejlesztjük ki. A kivonatokban adott esetben jelenlevő 32 999 RP-t a kifejlesztés után a kromatogramnak napfényben vagy 254 nm ultraibolya fényban való vizsgálatával mutatjuk ki. 2. A 32 999 RP jelű vegyület kitermelésének mennyiségi meghatározására kovasavgél vékonyréteglemezekre (Merck 60 F 254 minőségű, fluoreszkáló indikátoros üveglapon) a kivonatoknak a minőségi kromatografálás alapján megállapított 10 és 100/uliter közötti mennyiségét felvisszük. Ugyancsak felvisszük a lemezekre a tiszta, 32 999 RP jelű minta 0,5 és 1,5/ag közötti mennyiségeinek sorozatát. A lemezeket a fenti oldószerkeverékkel fejlesztjük ki. Kifejlesztés után a lemezeket „Chromoscan” lemez-leolvasóra visszük, ez a kivonatokban levő 32 999 RP jelű vegyületnek megfelelő csúcsokat regisztrálja. Kiszámítjuk ezen csúcsok területeit, valamint a vonatkozási anyagként használt tiszta 32 999 RP minta sorozatnak megfelelő csúcsok területeit, és ebből meghatározzuk a tenyészetekből kitermelt 32 999 RP jelű vegyület mennyiségét. A szulfanilamidot tartalmazó tenyészeteket ilyen módszerrel mennyiségileg meghatározva, a következő eredményeket kapjuk: Csoport Szulfanilamid 32 999 RP Ai 0 g/liter 0 mg/liter, a2 0,2 g/liter 0 mg/liter. A3 0,4 g/liter-h mg/liter, a4 0,6 g/liter 42 mg/liter, A5 0,8 g/liter 33 mg/liter, A« 0,6 (3 • 0,2) g/liter 50 mg/liter. 12. példa A 11. példa szerint előállított folyékony A táptalajt 50—50 ml-enként 300—300 ml-es lombikokba osztjuk szét. Ugyancsak a 11. példa szerint állítunk elő 10mg/ml koncentrációjú szulfanilamid-oldatot. A steril folyékony A táptalajt tartalmazó lombikokat párosával 4 csoportba, az A,, A,’, As és A5’ csoportokba osztjuk, és a következő módon készítjük elő ezeket: Az A5 és As ’ lombikok mindegyikébe 4 ml szulfanilamid-oldatot adunk (0,8 g/liter koncentráció), • Az Aj és A!’ lombikokba nem adunk adalékanyagot. Ezután az összes lombikot a következő módon oltjuk be: Az Aj és A; lombikok tartalmát egyenként 2,5—2,5 ml Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046) törzs 72 órás tenyészetével, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
