175142. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyújtott hatású csekély antigénhatással rendelkező inzulin-készítmény előállítására
5 175142 6 mazó szerves bázis vizes oldatával elegyítjük, majd a kapott terméket izoláljuk. Ezzel az eljárással biztonságosan kiküszöbölhetjük az inzulin-aggregátumok képződését, ugyanis a tisztított inzulint nem különítjük el először, ami aggregátumképződéssel járna. Az eljárás igen egyszerűen végrehajtható, és végtermékként stabil, nyújtott hatású inzulin-készítményt szolgáltat. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa 250 mg átkristályosított szarvasmarha-inzulint 5,2 ml stabilizált pufferoldatban (literenként 7 mól ionmentes karbamidot és 0,02 mól trisz-puffert [trisz(hidroxi-metil)-amino-metán] tartalmazó oldat, pH = 8,1) oldunk, és az oldathoz 5,2 ml 7 mólos karbamid-oldatot adunk. Az elegy pH-ját 8,1-re állítjuk. 5 cm átmérőjű oszlopba, 2,1 cm magasságig DEAE-cellulózt (Whatman DE 52) rétegezünk, és az adszorbenst a fenti összegképletű pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. Az inzulint tartalmazó oldatot átbocsátjuk az oszlopon, majd az oszlopot 75 ml/óra sebességgel a következő rendszerekkel eluáljuk: a fenti összegképletű pufferoldat (eluálás ideje: 2,5 óra), literenként 0.0045 mól nátriumkloriddal kiegészítettt, egyébként a fentiekkel azonos összetételű pufferoldat (eluálás ideje: 3 óra), és literenként 0,011 mól nátriumkloriddal kiegészített, egyébként a fentiekkel azonos összetételű pufferoldat (eluálás ideje: 12 óra). Az eluátumot frakciókba gyűjtjük. A nagy tisztaságú inzulint tartalmazó frakciókat egyesítjük, és meghatározzuk az elegy inzulin-tartalmát. Az így kapott elegyével azonos térfogatú 7 mólos karbamid-oldatban az izofán inzulin/protamin arány biztosításához szükséges mennyiségű protamint oldunk. Az inzulintartalmú oldatot lassú ütemben, keverés közben a protamintartalmú oldatba csepegtetjük, — és adott esetben az elegynek 1 mól/liter karbamid-koncentrációig történő hígítása után — az amorf inzulin-protamin komplexet kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük. A termék 300/rg súlyú mintáját poliakrilamid-gélen izoelektromos fókuszálásnak vetjük alá, reagensként 6 mólos, ionmentes karbamid-oldattal készített, 2%-os amfolin-oldatot (pH 3—10) használunk. Egyetlen sáv jelenik meg. 2. példa Stabilizált puffer-oldatot készítünk az alábbi I. és II. oldat olyan arányú elegyítésével, hogy az elegy pH-értéke 6,0 legyen. Az I. oldat 7 mól ionmentes karbamidot és 0,13 mól nátriumhidrogénfoszfátot, a II. oldat pedig 7 mól ionmentes karbamidot és 0,13 mól dinátriumhidrogénfoszfátot tartalmaz. 400 mg átkristályosított szarvasmarha inzulint 3 ml kapott pufferelegyben oldunk, az oldat pH-értékét a II. oldat kis mennyiségének hozzáadásával 6,0-ra állítjuk be, és szűrjük. 2,5 cm átmérőjű oszlopot Amberlite (R) CG type II. gyanta 27 cm-es rétegével töltünk meg, az oszlopra a fenti összetételű pufferoldatot öntünk, és hagyjuk, hogy egyensúly alakuljon ki. Ezután felvisszük az inzulin-oldatot az oszlopra és 40 ml/óra sebességgel eluáljuk a fenti összetételű pufferoldattal. A tisztított inzulint tartalmazó frakciókat elkülönítjük, és az inzulintartalmat meghatározzuk. A tisztított frakciókkal azonos térfogatú 7 mólos karbamid-oldatban protamint oldunk, és a kapott oldathoz lassan, keverés közben hozzáadjuk az inzulin-oldatot. Hígítással a karbamid-koncentrációt 1 mólosra csökkentjük, és a protamin-inzulin komplex ilyen módon amorf állapotban kiválik. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük. Tisztasága megegyezik az 1. példa szerinti termékével. A kapott csapadék felhasználható inzulin-injekció készítéséhez, önmagukban ismert vivőanyagokban történő szuszpendálással. 3. példa Az 1. vagy 2. példában leírt eljárást ismételjük meg. A protamin-oldathoz annyi cinkkloridot adunk, hogy az 0,5% cinkiont tartalmazzon az inzulin mennyiségére számítva. Az oldat továbbá 0,3% m-krezolt is tartalmaz, az elegy térfogatára vonatkoztatva. Az elegy pH-értékét 6—9 között tartjuk, és a protamin-inzulin komplex kristályosán kiválik. A csapadékot centrifugáljuk. Gyakorlatilag egyetlen sávot tartalmaz, amikor 300jug mennyiséget izoelektromos fókuszálásnak vetünk alá poliakrilamid gélben, 6 mól ionmentesített karbamid-oldattal készített 2%-os amfolin-oldat (pH 3—10) alkalmazásával. A kapott termék felhasználható befecskendezhető inzulin gyógyszerkészítmények előállításához, önmagukban ismert vivőanyagok alkalmazásával. 4. példa Az 1. vagy 2. példában leírt eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy előzetesen Sephadex G—50 gélen gélszűréssel tisztított, átkristályosított szarvasmarha inzulinból indulunk ki. A kapott termék tisztasági foka megegyezik az 1. példa szerint előállított anyagéval. 5. példa A 4. példában leírt eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy átkristályosított és Sephadex G-50 gélen gélszűréssel tisztított szarvasmarha-inzulinból indulunk ki. A kapott termék tisztasági foka megegyezik az 1. példa szerint előállított anyagéval. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
