175142. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyújtott hatású csekély antigénhatással rendelkező inzulin-készítmény előállítására
7 175142 6. példa Az 1. vagy 2. példában leírt eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy protamin helyett 295-ös polimerizációfokú poli-L-arginint használunk fel. 7. példa Az 1. példában leírt módon járunk el, azonban a tisztított inzulint tartalmazó eluátumfrakcióhoz a jelenlevő inzulin mennyiségére vonatkoztatott 10 súly% bisz(4-amino-2-metil-kinolil-6)-karbamid-hidrokloridot adunk 0,2%-os, vizes oldat formájában. Adott esetben az oldatot 0,025 mólos nátriumfoszfát-pufferoldattal (pH = 7,3) 1 mól/liter karbamid-tartalom eléréséig hígítjuk, és az inzulintartalmú komplexet kicsapjuk. Az elegyet egy ideig állni hagyjuk, majd a csapadékot centrifugálással elkülönítjük. A kapott komplex tisztasági foka megegyezik az 1. példa szerint előállított anyagéval. 8. példa A 7. példában leírt eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy Sephadex G—50 alkalmazásával tisztított, átkristályosított szarvasmarha-inzulinból indulunk ki. A kapott termék tisztasági foka megegyezik az 1. példa szerint előállított anyagéval. 9. példa 2,6 cm átmérőjű és 80 cm magasságú oszlopot megtöltünk előzetesen puffer-oldattal duzzasztott és egyensúlyba hozott DEAE-Sephadex A-25 töltettel. A puffer-oldat literenként 0,15 mól ammóniumhidroxidot és 7 mól dimetilformamidot tartalmaz, és a pH-értékét 5 n sósav-oldattal 9,0-ra állítjuk be. Sephadex G—50 alkalmazásával gélszűréssel tisztított 300 mg szarvasmarha-inzulint 40 ml fenti összetételű puffer-oldatban oldunk, és az oldatot felvisszük az oszlopra. Ezután 2 órán át eluáljuk az oszlopot a puffer-oldattal 200 ml/óra sebességgel. Az elúciót ezután ugyanezzel a sebességgel folytatjuk, azonban lineáris grádienst hozunk létre 2700 ml fenti összetételű puffer-oldat és 2700 ml, literenként 0,25 mól ammóniumhidroxidot és 7 mól dimetilformamidot tartalmazó, 5 n sósav-oldattal 9,0 pH-értékre beállított puffer-oldat alkalmazásával, Az eluátumot frakciókra osztjuk szét. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és az inzulin-tartalmat meghatározzuk. Az oldat pH-értékét 7,9-re állítjuk be 5 n sósav-oldattal, és m-krezolt adunk hozzá 0,2% m-krezol-tartalomig. Ezután az oldat cink-tartalmát az inzulin súlyára számított 0,5%-ra állítjuk be és 1%-os vizes oldat formájában annyi protaminszulfátot adunk hozzá, hogy elérjük az izofán inzulin/protamin arányt. Az elegyet gondosan keverjük, majd 20 °C-on 15 percig állni hagyjuk. Ezután 6-szoros térfogatú, 7,3 pH-értékű, 0,2%-m-krezolt tartalmazó nátriumfoszfát puffer-oldatot adunk hozzá, és rövid ideig tartó keverés után az elegyet 16 órán át állni hagyjuk 20 °C-on. Ilyen módon kristályossá válik az amorf alakban kivált protamin-inzulin komplex. A terméket valamely, önmagában ismert vivő közeg alkalmazásával befecskendezhető inzulin-készítménnyé alakítjuk. Ha a termék 300/ig súlyú mintáját poliakrilamid-gélen izoelektromos fókuszálásnak vetjük alá, reagensként 6 mólos ionmentes karbamid-oldattal készített, 2%-os amfolin-oldatot (pH 3-10) használva, egyetlen sáv jelenik meg. 10. példa 2,6 cm átmérőjű és 4,4 cm magasságú oszlopot megtöltünk előzetesen puffer-oldattal duzzasztott és egyensúlyba hozott QAE—Sephadex A—25 töltettel. A puffer-oldat 60 térfogat%-os etanollal készített 0,1 mólos trisz(hidroximetil)-amino-metánból áll, amelynek a pH-értékét 5 n sósav-oldattal 7,35-re állítjuk be. Sephadex G-50 alkalmazásával gélszűréssel tisztított 250 mg szarvasmarha-inzulint 60%-os etanollal készített és sósavval 8,5 pH-értékre beállított, 10 ml 0,1 mólos trisz(hidroximetil)-amino-metán-oldatban oldunk, az oldatot szüljük és felvisszük az oszlopra. Az oszlopot ezután az egyensúly kialakításához alkalmazott puffer-oldattal eluáljuk 10 ml/óra sebességgel. Az eluátumot frakciókra bontjuk, a tiszta frakciókat összegyűjtjük és az inzulin-tartalmat meghatározzuk. Ezután annyi m-krezolt adunk az oldathoz, hogy az 0,2%-m-krezolt tartalmazzon. A cink-tartalmat az inzulin súlyának 0,5%-ára állítjuk be, és annyi protaminszulfátot adunk az oldathoz 1%-os vizes oldat alakjában, hogy az izofán inzulin/protamin arányt elérjük. Az elegyet óvatosan keverjük, 15 percig 20°C-on állni hagyjuk, majd 9-szeres térfogatú, 7,3 pH-értékű, 02% m-krezolt tartalmazó nátriumfoszfát puffer-oldatot adunk hozzá, és rövid ideig tartó keverés után az elegyet 16 órán át állni hagyjuk 20 °C-on. Ilyen módon kristályossá válik az amorf alakban kivált protamin-inzulin komplex. A terméket valamely, önmagában ismert vivő közeg alkalmazásával befecskendezhető inzulinkészítménnyé alakitjuk. Ha a termék 300/rg súlyú mintáját poliakrilamid-gélen izoelektromos fókuszálásnak vetjük alá, reagensként 6 mólos ionmentes karbamid-oldattal készített, 2%-os amfolin-oldatot (pH 3-10) használva, egyetlen sáv jelenik meg. 11. példa 5 °C-ra hűtött helyiségben 2,6 cm átmérőjű és 11 cm magasságú oszlopot előzetesen puffer-oldattal duzzasztott és egyensúlyba hozott QAE Sephadex A—25 töltettel töltünk meg. A puffer-oldat 8 mólos acetamiddal készült 0,5 mólos trisz(hidr-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
