175050. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás neomycin előállítására
3 175050 4 mindaddig, míg a kolóniakezdemények csaknem mindegyike legalább 3 oldalhajtással nem rendelkezett. Ezután a tenyészetből a kicsírázott egyedeket kiszűrtük és a szűrőn átment csírázatlan spórákat szélesztettük. Egyik ilyen szélesztményből izoláltuk az LN-47 jelzésű, 00165 szám alatt deponált Streptomyces fradiae törzset. A fenti nemesítési eljárás során a túlélési százalék 19 volt. Előszelekcióval a túlélő egyedek 99,4%-át kiszűrtük. Az előállított új törzs termelőképessége csak abban az esetben haladja meg a kiinduló törzsünk termelőképességét, ha a tenyésztési eljárásokat optimalizáljuk. Az új törzsben rejlő magas bioszintetizáló képességet akkor tudtuk kihasználni, ha a tenyésztést 3 fázisban végeztük — ahogyan azt a 4. példában leírtuk. E szerint az 1. fázis az inokulum, a 2. fázis az előfermentáció és a 3. fázis a fermentáció. Eredményeink szerint tehát az eddig ismertnél magasabb hozamú fermentációk érhetők el, ha a tenyésztés mind a három fázisát végigvisszük az 1-ből a 2-be 10% tenyészlevet oltunk, a 2-ből a 3-ba ugyancsak 10% tenyészlevet oltunk. Azonos eredmény érhető el, ha az 1. fázis kihagyásával a 2. fázisból 10%-kal egy másik 2. fázisú táptalajt oltunk és ebből 10%-kal a 3. fázisú táptalajt oltjuk. Ez esetben a tenyésztés első fázisa kihagyható. Az 1. fázisból a 3. fázis oltása nem valósítható meg. mert ilyen körülmények között a tenyészet a 3. fázis igen magas szénforrás tartalmát nem metabolizálja. Ugyanakkor spórás oltóanyaggal indítani csak az 1. fázist lehet. Eljárásunk alkalmazása során tehát a tenyésztés 2. fázisa döntő fontosságú, így ez a tenyésztési fázis nem hagyható el. Eljárásunk haladó volta a 4. példa adatainak az 1., 2. és 3. példák adataival történő összevetéséből tűnik ki. Míg a neomycin előállítására korábban alkalmazott 6/11 jelű Streptomyces fradiae törzs termelési csúcsértéke a fermentáció 136. órájában 5350 gamma/ml illetve 5890 gamma/ml volt két illetve három fázisban végzett tenyésztéssel, addig az általunk előállított LN—47 jelű 00165 számon letétbe helyezett törzs termelési csúcsértékei két fázisban végzett tenyésztéssel 12300 gamma/ml, míg három fázisban végzett tenyésztéssel 18700 gamma/ml volt azonos fermentációs idő és energiahasznositás mellett. Eredményeinket az 1. sz. táblázatban foglaljuk össze. 1. sz. táblázat Törzs 2. fázis 3. fázis Csúcsérték a 136. órában (gammal/ml) 6/11 +-5350 6/11 + + 5890 00165-12300 00165 + + 18700 Az eljárásunk szerint végzett fermentáció termelési csúcsértéke a szabadalmakban és irodalomban megadott és eddig ismertetett legmagasabb értékhez képest is (17000 gamma/ml: Amerikai Egyesült Államok-beli ^ 352 761 számú szabadalmi leírás, 1967.) 10% többlethozamot jelent. Eljárásunk további előnye, hogy a táptalajban a költséges amilopektin illetve burgonyakeményítő helyettesíthető az olcsó, hazai forrásokból beszerezhető kukoricafinomítvánnyal. Eljárásunk lehetővé teszi továbbá, hogy a költséges savállóacél fermentorok helyett a meglevő szénacél fermentorokat alkalmazzuk a neomycin előállítására, elkerülve a beruházásból eredő jelentős többletköltségeket. Eljárásunk azt a meglepő felismerést alkalmaztuk, hogy az LN—47 jelű, 00165 számon letétbe helyezett törzs nagyobb szénhidrátfogyasztással volt jellemezhető, ha az 1. fázist egy olyan adaptációs (szoktatási) fázis (2. fázis) követte, amelynek táptalaja magas %-ban könnyen metabolizálható szénhidrátot és alacsony %-ban nehezen metabolizálható organikus nitrogént tartalmazott. A 2. fázisban a 0,18—0,22% nehezen metabolizálható nitrogén, 1,8—2,2% könnyen metabolizálható szénhidrát és 3,8—4,2% nehezen metabolizálható szénhidrát tartalmú táptalajon ugyanis a tenyészet úgy volt továbbnöveszthető, hogy kialakultak a nehezen metabolizálható szénhidrát intenzív fogyasztásának a feltételei. A 2. fázisban kialakult tenyészet megnövekedett szénhidráthasznosító képessége következtében a tenyésztés 3. fázisában a keményítőt jól hasznosította, ezáltal a 3. fázis táptalaját a hatékonyabb neomycin bioszintézis igényeihez illeszthettük: a 0,38—0,45% nehezen metabolizálható nitrogén az 5,8-7,0% nehezen metabolizálható szénhidrát és a 0. 18-1,2% könnyen metabolizálható szénhidrát tartalmú táptalaj, 3,5-szeresére növelte a fermentáció hatékonyságát. Ugyancsak a 2. fázis közbeiktatása tette lehetővé, hogy a 3. fázis táptalajában 21%-kal növeljük az összes szénhidráttartalmat, az összes szénhidráttartalmon belül pedig 7,25—5,8 : 1 arányúra módosítsuk a keményítő-glükóz arányt. Ehhez a jelentős árcsökkentő hatáshoz járult hozzá az a megtakarítás, amely a költséges — és főként importból beszerzett — burgonyakeményítő kukoricafinomítvánnyal való felváltásából eredt. A fentieket igazolta az a kísérletünk, amelyoen a 3. fázis magas termelőképességét nem tudtuk biztosítani, ha azt közvetlenül az 1. fázis táptalaján növesztett tenyészettel oltottuk. 1. példa A 6/11 jelzésű törzsből 200 cm2 felületű szilárd táptalajon spóraszuszpenziót állítottunk elő oly módon, hogy a beoltott táptalajt 28 °C-on, 168 órán át inkubáltuk. A táptalaj összetétele a következő volt: 5 10 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65 2
