175049. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új BU-2231 jelű glikopeptid-antibiotikum-komplex, az egyes komponensek és származékok előállítására
29 175049 30 nens 40 mikrogramm/kg-os dózisa esetében az öszszehasonlító anyaghoz képest megnőtt a túlélési idő (T/C = 157), ami jelzi, hogy a Bu-2231 A és B négyszer hatékonyabb. Az A komponens valamivel hatékonyabb, mint a B (10 mikrogramm/kg dózis- 5 ban is aktív), de nem tekinthetjük ezt a különbséget szignifikánsnak. 16. táblázat: 10 Lewis-Lung carcinomával szemben a bleomicin hatása a hatékonyság határán van. E kísérletben az 1 mg/kg-os dózisban adott Bu-2231 A majdnem elérte a hatékonyság kritériumát (T/C = 123), a Bu—2231 B viszont 2 és 1 mg/kg-os dózisokban 15 aktív volt. A találmány szerinti eljárást a következőkben, a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül, példákkal szemléltetjük. A „CM-Sephadex C-25” egy mikroszkopikus méretű szemcsékből álló, száraz, 20 oldhatatlan, porszerű, kémiailag a dextrán nevű poliszacharidból levezethető, és karboximetil funkciós csoportokat tartalmazó szintetikus szerves anyag kereskedelmi neve (előállítja: Pharmacia Fine Chemicals Inc.). Az „Amberlyst 15” a Rohm and 25 Haas Company által előállított egyik ioncserélő gyanta kereskedelmi neve. Az „Amberlite XAD-2” a Rohm and Haas Company által előállított, sztirol-divinilbenzol-kopolimer alapú adszorbens gyanta kereskedelmi neve. 30 1. példa A komplex fermentációs előállítása 35 A Bu—2231 antibiotikum-komplexet termelő Streptoalloteichus hindustanus E465—94 ATCC - 31158 törzs egy jólnövekedő ferdeagar-tenyészetével a következő alkotóelemeket tartalmazó folyé- 40 kony vegetatív közeget oltjuk be: 1,5% glükóz, 0,5% polipepton, 0,2% élesztőkivonat, 0,05% dikálium-hidrogén-foszfát és 0,05% magnézium-szulfát-heptahidrát. 28 °C-on 2 napon át tenyésztjük ezt az oltó tenyészetet egy percenként 250-et forduló 45 forgó rázóasztalon, majd a tenyészet 2 ml-nyi mennyiségét egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő, 100 ml térfogatú, 2% glicerint, 1% Pharmamedia-t (Pharmacia), 1% kukoricalekvárt, 0,3% ammónium-szulfátot, 0,003% cink-szulfát-heptahidrátot és 50 0,4% kalcium-karbonátot tartalmazó táptalajhoz adjuk. A termelt antibiotikum mennyisége 3-5 napos, 28 °C-on végzett rázatás után éri el a maximumot. 2 2. példa Extrakció és tisztítás 60 Az 1. példában leírt módon, több lombikból nyert tenyészlevet (térfogata kb. 10 liter, koncentrációja: 50 mikrogramm/ml) szüljük, és 7-es pH-értéknél 900 ml térfogatú, ammónium-fázisú Amberlite IRC-50 ioncserélő gyantán kötjük meg a szűr- 65 letben levő bioaktív anyagot. 5 liter vízzel, majd a nebramicin faktorok eluálása céljából 4 liter 0,25 normál ammónium-hidroxid-oldattal mossuk a gyantát. Ezután 2-es pH-jú sósavoldattal (3 x 1 liter) eluáljuk a Bu—2231 komplexet a gyantáról. Egyesítjük a Bu—2231-et tartalmazó frakciókat, 30 g aktívszénen megkötjük, és 2-es pH-jú vizes butanollal (3 x 1 liter) eluáljuk. Elválasztjuk a butanolos fázist, és csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert a vizes fázisról. Amberlite XAD-2-n, majd Sephadex LH—20-on kromatografálva tisztítjuk az előbbi módon nyert szilárd nyersterméket (súlya: 1,2 g), ily módon 150 mg halványzöldes színű, porszerű Bu—2231 komplexet nyerünk rézkomplex formájában. 3. példa A komponensek szétválasztása Az egyes komponensek szétválasztása céljából 3 ml 0,7%-os réz(II)-klorid oldatban feloldunk 140 mg Bu—2231 komplexet, és egy 85 ml CM-Sephadex C-25-tel töltött oszlopra visszük fel az oldatot. 1%-tól 7%-ig növekvő koncentrációjú vizes ammónium-formiát-oldattal végzett gradiens elúcióval eluáljuk a komponenseket az oszlopról. A Bu—2231 B a 3%-os ammónium-formiát-c! jattal mosható le, a Bu-2231 A pedig az 5%-ossal. Minden frakciót Sephadex LH—20-on kromatografálva só mentesítünk, csökkentett nyomáson betöményítjük, és fagyasztva szárítjuk a sűrítményeket, ily módon 84 mg Bu-2231 A-hangyasavas sót és 21 mg Bu—2231 B-hangyasavas sót nyerünk, mindkettőt rézkomplex formájában. A rézkomplex formájú anyagokat a 3 646 197 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás 1. példájában leírt általános módon metanolban kénhidrogénnel kezelve nyeljük a rézmentes hangyasavas sókat. 4. példa A Bu-2231 A sósavas sójának előállítása 2 normál metanolos sósavoldat hozzáadásával 750 mg rézmentes Bu-2231 A-hangyasavas só 100 ml metanollal készült oldatának pH-ját 2-re állítjuk be. Ezután kevertetés közben 300 ml acetonhoz csepegtetjük az ily módon nyert oldatot. Kiszűijük, majd csökkentett nyomáson megszárítjuk a kivált csapadékot, ily módon fehér porszerű anyag formájában 673 mg nyers Bu-2231 A-sósavas sót nyerünk. Egy 70 ml Sephadex lH-20-szal (a Pharmacia Fine Chemical által forgalomba hozott, módosított, alkilezett, dextrán alapú gél kereskedelmi neve) töltött oszlopra, amelyet 98%-os metanol felhasználásával töltöttünk fel, fel viszünk 140 mg fenti módon nyert nyers sósavas sót. 98%-os metanollal eluáljuk az oszlopot, egyesítjük a biológiailag aktív frakciókat, csökkentett nyomáson betöményítjük őket, majd fagyasztva szárítjuk a sűrítményeket, ily módon 105 mg rézmentes Bu—2231 A-sósavas sót nyerünk. 15
