175045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés sejttenyészet előállítására
13 175045 14 visszaáramoltatjuk a 10 tartályba a 19 szelepen keresztül. A habbevezetést ezután leállítjuk, és a sejteket eltávolítjuk a hordozóról, célszerűen olyan módon, hogy a tenyészetet tartalmazó edényt megtöltjük sejtfelszabadító oldattal, például tripszinnel. A hordozót kívánt esetben enyhén mozgathatjuk, hogy elősegítsük a sejtek felszabadulását. Ebből a célból gázt vezethetünk át a hordozón alulról a 18 csővezetéken keresztül, miközben zárva tartjuk a 19 és 20 szelepet. A sejtszuszpenziót ezután a 20 leürítő szelepen keresztül vezetjük el, miközben a 19 szelepet zárva, a 20 szelepet pedig kinyitva tartjuk. A találmány szerinti berendezést kívánt esetben gőzcsapdával is elláthatjuk. Erre a célra egy hűtő szolgálhat, amely a 17 baktériumszűrő alatt helyezkedik el. A berendezés kívánt esetben egy további gázbevezetést is tartalmazhat, amelynek elhelyezése olyan, hogy a gáz olyan ponton jusson be a berendezésbe, amely alatt a 18 visszavezető cső 18a és 18b részre oszlik. A találmányt az alábbi példák segítségével részletesen ismertetjük. 1. példa Az előzőkben ismertetett, találmány szerinti berendezés 3,5 cm átmérőjű edényét 25 cm magasságig megtöltjük 4 mm átmérőjű és 4 mm hosszúságú sajtolt polikarbonát hengerekkel, majd az egész berendezést 30 percig sterilizáljuk autoklávban 0,92 atm nyomáson végzett kezeléssel. Hagyjuk, hogy a berendezés lehűljön szobahőmérsékletre, kinyitjuk a 19 és 20 szelepet, és injekcióstű segítségével a 15 bevezetésen keresztül 100 ml táptalajban szuszpendált 3,6 x 107 L929 egér fibroblaszt sejtből álló oltóanyagot viszünk be. Az alkalmazott táptalaj Eagle-féle táptalaj, amely adalékanyagként Earle-sókat, 10% magzati marhaszérumot, nem-esszenciális aminosavakat, aszkorbinsavat és penicillint/sztreptomicint tartalmaz. A közeghez pufferként 2,2 g/liter nátriumhidrogénkarbonátot, és pH-indikátorként fenolvöröst adunk. Hagyjuk, hogy a beoltott berendezés 20 órán át álljon 37 °C-on, annak érdekében, hogy a sejtek leülepedjenek és a hordozóhoz tapadjanak. Amikor a sejtek leülepednek a porózus hordozóra, kissé kinyitjuk a 19 szelepet, hogy a folyadék leszivárogjon az edényből, és egyidejűleg 10% oxigénből, 85% nitrogénből és 5% széndioxidból álló gázelegyet vezetünk a habfejlesztő készülékbe 25 ml/perc sebességgel, úgy hogy a hab elérje a porózus hordozó tetejét, amikor a jelenlevő folyadék már leszivárog. A közegnek a 19 szelepen keresztül történő áramlását úgy szabályozzuk, hogy a sejtek szuszpendálásához alkalmazott közeget pótolja a habból képződött táptalaj közeg, és a hordozón jelenlevő sejtek ne száradjanak ki. Amikjpr a sejtek szuszpendálásához alkalmazott közeg eltávozik a toronyból, teljesen kinyitjuk a 19 szelepet, és a folyadéknak az oszlopon keresztül történő áramlását ekkor az a szétesési sebesség szabályozza, amellyel a hab a hordozó felületén folyadékká alakul. A hab keringtetését 72 órán át folytatjuk. Ezután az 1 habfejlesztő készülékbe történő gázbevezetést megszüntetjük, és a 19 szelepet lezárjuk. A 10 tartályt és az 1 habfejlesztő készüléket leürítjük a 12 szelepen keresztül, majd lezárjuk a 12 szelepet, és a 10 tartályt megtöltjük mosófolyadékkal, amely 0,15 mólos nátriumklorid-oldat, adalékként 0,1% metil-cellulózt tartalmaz és a pH-értéke 7,3-ra van beállítva foszfát pufferrel. A mosó folyadékot habosítjuk, átvezetjük a 2 edényen és elöntjük a 18b csővezetéken és a 20 szelepen keresztül. A mosást addig folytatjuk, amíg a sejtekből ki nem mossuk a vörösszínű táptalaj utolsó nyomait is. A 20 szelepet lezárjuk és annyi 37 °C hőmérsékletű tripszin/verzol oldatot vezetünk az edénybe a 15 bevezetésen keresztül, hogy ellepje a porózus hordozót, majd 10 perc elteltével a töltetet és az oldatot 5 percig enyhén rázatjuk enyhe steril légáram bevezetésével a 20 szelepen keresztül. A rázatás eredményeként a pufferoldatban szuszpendált sejteket elvezetjük a 2 edényből a 20 szelepen keresztül, majd további tripszin/verzol puffert adunk hozzá az esetleg még visszamaradt sejtek eltávolítására. Az összegyűjtött sejtek számát hemocitométerrel végzett számlálással határozzuk meg. A beoltáshoz használt sejtek száma 3,6 x 107 Összegyűjtött sejtek (i) a leürített táptalajban és a mosófolyadékban 0,8 x 107 (ii) tripszin/verzolban 5,25 x 10 összesen 6,05 x 10 2. példa Az 1. példa módszerének alkalmazásával emberi eredetű fibroblasztokat tenyésztünk, és interferont termelünk a következőképpen: 4 mm átmérőjű, szilikonnal kezelt polikarbonát gyöngyöket henger alakú üvegtoronyba töltünk úgy, hogy 5 cm átmérőjű és 15 cm magasságú rétegben helyezkednek el, majd beoltjuk a hordozót 2,5 x 107 mennyiségű emberi bőr/izom fibroblaszttal. A sejteket táptalajjal készített szuszpenzió formájában visszük be a berendezésbe, ahol a táptalaj minimális esszenciális Eagle-féle táptalaj, és Earle-sókat, 10% magzati marhaszérumot, nem-esszenciális aminosavakat, aszkorbinsavat, fibroblaszt növekedési tényezőt, penicillint/sztreptomicint és 0,88 g/liter nátriumhidrogénkarbonátot tartalmaz. A beoltott hordozót inkubáljuk, és egy éjszakán át állni hagyjuk 37 °C-on. A szuszpenzió közegét lassan leürítjük, és megkezdjük a táptalaj adagolását. Ehhez 5% széndioxidot tartalmazó steril levegőt vezetünk a folyékony táptalaj mellett a habfejlesztő készülékbe. A gázelegy mennyiségét úgy szabályozzuk, hogy biztosítsa a táptalaj helyes pH-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
